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05)。通过相应信号通路抑制剂添加发现p38磷酸化被抑制后IL-8mRNA表达及因子分泌水平极显著降低(p
研究背景 还有 卵巢癌目前是死亡率最高的妇科肿瘤疾病,发病隐匿、高复发及易扩散转移是其重要的临床特征。越来越多的研究证明,恶性肿瘤组织中存在着一小部分拥有干细胞样细胞性质的群体,即肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或称为肿瘤干细胞样细胞(cancerstem-like cells,CSLCs),其在肿瘤的发生、发展、复发及侵袭转移中起着十分重要的作用。在卵巢癌中也存在着肿瘤干细胞,即卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs),其对卵巢癌的发生、发展、复发及转移同样具有重要作用。因此,从卵巢癌干细胞样细胞这一角度进行研究是治疗卵巢癌的新策略。 肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比,除了具有更强的侵袭、转移能力,更强的化疗抵抗能力以外,最本质的差别是其具有干细胞特性,即自我更新(self-renewal)。不管是肿瘤的发生还是复发和转移灶的形成,都有赖于肿瘤干细胞的自我更新能力。因此,阐明肿瘤干细胞的自我更新机制是研究肿瘤干细胞的关键。

肿瘤干细胞的自我更新不仅依赖于其自身内在的信号调控,同时也受到肿瘤微环境的调控,其中,肿瘤相关性炎症最为关键。然而肿瘤相关性炎症对卵巢癌干细胞的自我更新调控作用及机制却缺乏系统深入的研究。 我们前期从卵巢癌中成功分离出的CD133+卵巢癌干细胞样细胞(CD133+ovariancancer stem-like cells,CD133+OCSLCs)具有肿瘤干细胞的特性,其能够作为我们研究卵巢癌干细胞自我更新生物学特性的模型。为此,本课题探讨肿瘤相关性炎症对CD133+OCSLCs自我更新的调控作用及其机制。

AZD6738 研究目的 1.检测CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体的表达。 2.明确IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 3.阐明IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新的机制。 研究方法 围绕上述研究目的,我们采用以下研究方法: 一、CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体 1.通过人炎症反应PCR芯片(Human Inflammatory Response PCR Array)技术,比较A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌细胞系细胞)中炎症因子和相关受体mRNA的表达。 2.通过流式细胞、免疫荧光技术验证IL-17R在A2780卵巢癌细胞系,A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和人卵巢癌组织中的表达情况。 二、IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用 1.通过免疫组化,免疫荧光技术检测IL-17的来源细胞。 2.通过肿瘤干细胞成球实验及受体阻断实验研究IL-17体外对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs自我更新的作用。 3.通过构建IL-17过表达慢病毒后裸鼠体内荷瘤实验研究IL-17对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs体内成瘤能力的影响。 三、IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新作用的机制 1.通过全基因组表达谱芯片技术筛选IL-17调控A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs自我更新的相关基因并通过qPCR验证。 那个 2.结合自我更新相关基因和生物信息学方法筛选IL-17下游信号通路。 3.通过western-blot,免疫荧光和抗体阻断等方法研究NF-κB及p38MAPK两条信号通路在IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 研究结果 1.CD133+OCSLCs表面表达IL-17R 我们通过PCR-array技术,比较了A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs之间的基因差异,结合这些差异基因的生物学作用,我们选择对IL-17参与CD133+OCSLCs自我更新进行深入研究。

免疫荧光和流式细胞技术结果显示A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs表面表达IL-17R并且其表达高于非OCSLC。在新鲜人卵巢癌组织中,通过免疫荧光发现IL-17R表达于原代卵巢癌来源的CD133+OCSCs表面。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有相互作用的物质基础。 2.IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新 因为IL-17R需要与其配体IL-17相结合才能发挥功能,因此我们首先通过免疫组化检测发现人新鲜卵巢癌组织中存在表达IL-17的细胞,其主要分布于卵巢癌间质内。免疫荧光进一步证实:表达IL-17的细胞主要为CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞,并且这类细胞与CD133+OCSLCs在人卵巢癌组织中处于同一niche之中。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有空间上相互作用的可能性。 通过衡量A2780卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs在IL-17刺激后的成球数量和成球大小,证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs自我更新的作用,经过IL-17R抗体阻断实验进一步证明IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的作用依赖于IL-17R。 通过慢病毒介导的基因转染方法建立稳定表达人IL-17的CD133+OCSLCs,结合免疫荧光和ELISA验证IL-17转染效率,成球和受体阻断功能实验验证IL-17转染后促进CD133+OCSLCs自我更新。通过裸鼠体内荷瘤实验证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs体内成瘤的能力。 3.IL-17通过NF-κB和p38MAPK两条信号通路调控CD133+OCSLCs自我更新 通过基因表达谱芯片比较IL-17刺激和未刺激的卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs差异基因,在此基础上分别通过:1.筛选出8个自我更新相关基因,qPCR验证后,通过在线转录因子查找的方法,证实p65和/或AP1为8个自我更新相关基因的转录因子(除TCL1A);2.

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