5, 5 ,25,50和100μmol/L的无血清培养基培养U266细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于培养瓶中,30min后收集培养细胞待检。 2.检测指标: (1)Western blot技术测定IκB上游激酶IKKα, IKKβ的表达和磷酸化情况;
(2)Western blot技术测定胞浆提取物中IκBα蛋白表达和磷酸化水平; (3)细胞免疫荧光染色技术分析NF-κB/p65蛋白在细胞中的表达和分布; (4)Western blot技术测定胞核提取物中NF-κB /p65蛋白表达水平; (5)Transcription Factor Assay kit试剂盒(酶联免疫吸附技术(ELISA))测定胞核提取物中p65蛋白与DNA靶序列结合能力。 结果 1.氯化镧对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响: (1)氯化镧对LPS诱导的NF-κB活化的抑制作用:氯化镧(2.5μmol/L)能够显著抑制LPS诱导NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核,并且显著减弱NF-κB/p65与靶DNA结合活性。 (2)氯化镧对LPS诱导的IκBα降解的抑制作用:氯化镧显著抑制LPS诱导的胞浆IκBα降解,从而抑制了NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核。 此网站 (3)氯化镧对LPS诱导的IκBα磷酸化的抑制作用:氯化镧不能阻断LPS介导的RAW264.7巨噬细胞中IκBα的磷酸化。 (4)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响RAW264.7巨噬细胞中IKKα/β表达和磷酸化水平,从而不能阻断LPS介导的IκBα的磷酸化。 在RAW264.7细胞株中,NF-κB激活剂LPS诱导IKKβ及IκBα磷酸化,令IκBα降解,最终使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合。氯化镧虽然不能阻断IKKβ及IκBα磷酸化,但是能够阻止RAW264.7细胞中IκBα的降解,并抑制NF-κB/p65转位入核并抑制NF-κB/p65与靶基因的结合活性,最终阻断NF-κB信号转导通路。 那个 2.氯化镧对TNF-α诱导的Hela细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响: (1)氯化镧对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用:25-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导NF-κB/p65蛋白表达水平并抑制其自胞浆转位到细胞核,5-100μmol/L氯化镧还能显著减弱Hela细胞中NF-κB/p65与靶DNA结合活性,上述抑制效应呈剂量依赖关系。 (2)氯化镧对TNF-α诱导的IκBα磷酸化和降解的抑制作用:TNF-α能够诱导Hela细胞中IκBα的磷酸化和降解。随着氯化镧处理的浓度不断升高,IκBα表达水平逐步升高,而磷酸化水平不断降低。表明氯化镧能够抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化和表达水平的降低,且该效应随着随着氯化镧浓度的升高而逐步增强。
(3)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响Hela细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达水平。静息状态的Hela细胞几乎不表达p-IKKβ,而在TNF-α诱导下p-IKKβ水平则明显升高,随着氯化镧处理浓度的逐渐升高,p-IKKβ水平逐步下降,50-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导Hela细胞中IKKβ的磷酸化。 没有 NF-κB的另一个激活剂TNF-α,亦通过磷酸化IKKβ及IκBα,导致IκBα降解,最终亦使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合,启动相关基因的表达。在Hela细胞株中,氯化镧不仅能够抑制IκBα的降解和NF-κB/p65转位入核,阻断NF-κB/p65与靶基因的结合,还能够阻断IKKβ及IκBα磷酸化。可见在不同细胞及激活条件下,氯化镧抑制NF-κB信号通路的靶点不完全相同。 3.氯化镧对U266细胞中NF-κB的组成性活化(constitutive activation)的影响: (1)氯化镧对NF-κB组成性活化的作用:0-100μmol/L的氯化镧不能抑制NF-κB的组成性活化,逆转p65蛋白的移位。
(2)氯化镧对U266细胞中IκBα蛋白的表达和磷酸化的作用:0-100μmol/L氯化镧亦不能影响IκBα蛋白的表达和磷酸化水平。 (3)氯化镧对U266细胞中IKKs活性的影响:0-100μmol/L的氯化镧对U266细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达和磷酸化水平影响不明显。 (4)氯化镧在胞外条件下,对U266细胞核提取物中NF-κB/p65与DNA的结合能力的影响:实验表明在细胞外条件下,5μmol/L氯化镧即能够显著抑制p65蛋白与靶DNA结合活性,并且该抑制效应随着氯化镧浓度的增高不断增强,100μmol/L氯化镧能够完全抑制胞核提取物中NF-κB/p65与靶DNA的结合。研究结果提示:对于NF-κB组成性活化U266细胞,氯化镧不影响IKKβ的磷酸化及IκBα的磷酸化和降解,并无法逆转NF-κB转位,但能够在细胞外条件下阻断NF-κB/p65与靶DNA的结合。 第III部分氯化镧对LPS诱导NF-κB调控的炎症介质表达的影响目的通过观察氯化镧对LPS诱导的炎性因子TNF-α、NO及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达水平及活性的作用,了解氯化镧对LPS诱导NF-κB下游靶基因表达的影响。 方法 (1)实验分组:(同第I部分)。 (2)逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)测定TNF-α及iNOS基因表达水平。 (3)酶联免疫吸附技术(ELISA)测定细胞上清中TNF-α含量。 (4)细胞免疫荧光染色技术分析iNOS蛋白在细胞中的表达和分布。 (5) Western blot技术测定细胞中iNOS蛋白表达水平。 (6)硝酸还原酶法检测培养上清NO含量。 结果 (1)氯化镧对LPS诱导的NF-κB下游炎症介质TNF-α表达和释放的抑制作用:2.5μmol/L氯化镧不仅能够下调静息状态下巨噬细胞TNF-α基因的表达和多肽的释放还能够显著抑制LPS上调TNF-α基因表达和多肽释放。 (2)氯化镧对LPS诱导NF-κB下游基因iNOS表达的抑制作用:2.