GFP-LC3聚集实验表明IMB-6G能够引起LC3点状聚集显著增加,同时通过免疫印迹方法,检测到IMB-6G可时间和浓度依赖性地升高LC3-Ⅱ和p62蛋白的表达水平,初步说明IMB-6G抑制了胰腺癌细胞内自噬的活性。接着通过LC3 Turnover实验,加入自噬抑制剂CQ和自噬诱导剂Rapamycin。在IMB-6G与CQ合用后,细胞内LC3-Ⅱ水平没有此网站进一步升高,说明IMB-6G很可能与CQ作用相似,也是通过抑制自噬溶酶体途径而抑制LC3-Ⅱ的降解。而IMB-6G与Rapamycin合用后LC3-Ⅱ水平明显升高,证实了 IMB-6G抑制胰腺癌细胞内自噬体的降解。随后,我们在MiaPaCa-2细胞中表达mCherry-GFP-LC3双荧光质粒,由于mCherry红色荧光在酸性环境https://www.selleck.cn/products/Nilotinib.html中相对稳定不易淬灭,而GFP绿色荧光不稳定易淬灭,利用mCherry荧光与GFP荧光的表达差异,判断自噬的活性变化。Confocal结果显示,IMB-6G处理使细胞内绿色荧光和红色荧光点状聚集均明显增加,表明细胞中的自噬体数目增加,但自噬溶酶体的降解活性受到了抑制,说明IMB-6G抑制了胰腺癌细胞内的自噬流。之后,利用溶酶体荧光探Nutlin-3a分子量针LysoSensor/LysoTracker检测溶酶体的活性,结果发现IMB-6G作用后LysoSensor绿色荧光和LysoTracker红色荧光均未有明显变化,说明IMB-6G对溶酶体的酸性没有影响。由于溶酶体的降解活性主要受溶酶体内酸性环境和酸性水解酶的影响,因此我们检测了溶酶体内水解酶的活性。通过DQ-BSA染色发现IMB-6G处理后,溶酶体内的红色荧光明显减少,说明溶酶体内水解酶的活性受到了抑制。