2 TGF-β1诱导VSMC分化标志基因SM22α和SMα-actin表达 SM22α和SMα-actin表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志, PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要标志。采用Western blot方法,检查TGF-β1对各种标志基因表达的影响。结果显示,在TGF-β1处理的VSMC中,分化标志基因SM22α和SMα-actin表达明显升高,而增殖标志物PCNA表达显著降低,这些基因的表达变化依赖于TGF-β1作用的时间和浓度。其中,浓度为2 BMN 673化学结构 ng/ml和作用时间为48 h时变化最为显著。 1.3敲减TβRI表达对VSMC分化和去分化标志基因表达的影响 将靶向TβRI的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性TβRI表达后,研究TβRI在TGF-β1诱导VSMC分化中的作用。Western blot结果显示,转染TβRI-siRNA可使TβRI mRNA和蛋白表达水平降低约75~80%,表明该基因的表达被有效敲低。在TGF-β1刺激下,转染TβRI-siRNA的VSMC中SM22α和SMα-actin的表达明显降低,相反,增殖标志物PCNA的表达显著增加。 1.4 KLF4在TGF-β1诱导TβRI表达及VSMC分化中的作用 虽然已经发现KLF4是参与细胞生长、分化和凋亡的调控,但KLF4是否通过TβRI介导TGF-β1的作用目前尚不清楚。 RT-PCR和Western
blot结果表明,TGF-β1显著诱导KLF4和TβRI基因的转录和蛋白表达,并具有明显的时-效(6、12、24、48 h)关系。2 ng/ml TGF-β1作用于VSMC 6 h后,KLF4和TβRI的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,两者的表达变化呈正相关关系。 为了阐明KLF4与TβRI表达之间的关系,将KLF4-siRNA导入VSMC,阻断内源性KLF4表达后,明确KLF4在TGF-β1诱导TβRI及VSMC分化标志基因表达中的作用。RT-PCR和Western HKI 272 blot分析结果显示,转染KLF4-siRNA可敲减KLF4表达60%以上。在敲低KLF4表达的VSMC中,TGF-β1诱导TβRI表达的作用被取消,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也明显下降,表明KLF4介导TGF-β1对TβRI表达的诱导作用。 另外,将KLF4腺病毒表达载体Ad-KLF4感染VSMC,观察强制表达KLF4对TβRI和VSMC分化标志基因表达的影响。RT-PCR和Western blot分析证实,在KLF4过表达的VSMC中,TβRI表达明显高于空载体对照组,与此同时,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也显著升高。 2. TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号通路诱导KLF4磷酸化和KLF4与Smad2/3相互作用 TGF-β1通过与VSMC上的相应受体相互作用而触发细胞信号的跨膜转导,进而活化Smad信号通路而激活相关基因表达。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是胞内信号进行交互作用的重要信号转导通路。在上述阐明KLF4通过TβRI介导TGF-β诱导VSMC分化的基础上,本部分实验探讨TGF-β1对Smad和MAPK信号途径的影响,以期阐明TGF-β1诱导KLF4活化和促进细胞分化的信号转导机制。
2.1 TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4磷酸化 VSMC经TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min,用磷酸化丝氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后检测磷酸化KLF4的水平。结果显示,随着TGF-β1刺激时间的延长,磷酸化型KLF4水平逐渐升高,在TGF-β1刺激20~40 min内,其磷酸化水平增加2倍;同时,TGF-β1刺激后,磷酸化型Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)和p38 MAPK(p-p38)水平也显著升高。 分别以TβRI特异性抑制剂SB431542、p38特异性抑制剂SB203580和ERK特异性抑制剂PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 Autophagy inhibitor ng/ml的TGF-β1刺激细胞40 min。Western blot结果显示,SB431542或SB203580预处理细胞可显著抑制KLF4磷酸化,而PD98059对KLF4磷酸化无明显影响。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4磷酸化不再产生明显影响。证明TGF-β1诱导的KLF4磷酸化依赖于Smad和p38 MAPK信号途径的激活。 2.2 TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3相互作用 免疫共沉淀分析结果显示,VSMC被TGF-β1处理后,KLF4与Smad2/3相互作用形成的复合物明显增加。VSMC在TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min后,随着刺激时间的延长,KLF4与Smad2/3的结合明显增加,交互免疫沉淀也得到相似的结果。表明,TGF-β1能显著促进KLF4与Smad2/3的相互作用,并具有明显的时效关系。 为了检查KLF4磷酸化是否影响其与Smad2/3的相互作用,以SB431542、SB203580和PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 ng/ml TGF-β1刺激细胞40 min。免疫共沉淀分析结果显示,在SB431542和SB203580预孵育的VSMC中,KLF4与Smad2/3的相互作用明显降低,交互免疫沉淀得到相似的结果。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4与Smad2/3的相互作用不再产生明显影响。上述结果表明,TGF-β1通过Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4发生磷酸化修饰,而磷酸化型KLF4与Smad2/3的结合活性明显增加。 KLF4磷酸化位点定点突变实验证明,转染KLF4磷酸化位点(S470A)突变体的细胞再用TGF-β1处理时,KLF4的磷酸化水平明显降低,KLF4与Smad2/3的相互作用较对照组(转染野生型KLF4表达载体)降低。这些结果进一步提示,TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3之间的相互作用。 2.