43%，mp：52~54℃。终产品经质谱、核磁验证为目的产物。 2、最佳的反应条件如下： （1）2,6-二羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶在三氯氧磷条件下合成6-氯-2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶。讨论了反应温度，反应时间，碱等对反应的影响。确定2,6-二羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶(2)氯代的最佳的反应条件是：2,6-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶：三氯氧磷：三乙胺的摩尔比是1:10:2，反应温度65℃，反应时间19h，产率：82.2%。 （2）6-氯-2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶在10%钯碳以及缚酸剂的条件下，合成2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶。讨论了10%钯碳的用量，反应温度，以及碱等对反应的影响，化合物(3)还原的最佳的反应条件：10%钯碳量是化合物(3)质量的5%，最佳反应温度：35℃，产率：85.0%。 结论：成功合成了目标化合物2-氯-3-氨基-4-三氟甲基吡啶，通过优化反应条件，提高了反应收率。
目的：通过体外特异阻断试验,观察TGF-β1/Smads信号通路在环孢素A致肾小管上皮细胞转分化中的作用,探讨ILK是否作为TGF-β/Smads信号通路下游因子参与肾小管上皮细胞转分化。
方法：1.构建ILK siRNA。2.大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)分设正常组及CsA诱导组,后者分别采用CsA不同浓度和时间处理,观察细胞增殖抑制情况,选择CsA最佳时间和最适浓度。3.将NRK52E细胞培养分为5组：空白对照组(A组)：仅加入含10%胎牛血清的H-DMEM培养基；CsA处理组(B组)：细胞培养液加CsA(1mg/L);干预1组(C组)：加TGF-β1阻断剂(SB431542,10umol/L)预孵一小时后再加入CsA CDK 抑制剂 (1mg/L)；干预2组(D组)：转染有效ILKshRNA(KD-ILKshRNA,剂量MOI=20)72h后加入CsA (1mg/L);干预3组(E组)：转染无效ILKshRNA (NC-ILKshRNA,剂量MOI=20)72h后加入CsA (1mg/L)。上述各组分设3复孔,培养48h。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1以及Smad2、Smad7、 ILK、FSP-1mRNA的表达,蛋白印迹法(Western-blot)检测TGF-β1、Smad7、ILK、
FSP-1的蛋白表达。 结果：1.从慢病毒载体pGCSIL-hU6/GFP-ILK-2中扩增、重组、酶切后获得大约7800bp, DNA测序结果与Genbank中报道的ILK基因序列一致。2.重组质粒转染NRK-52E细胞后可观察GFP荧光表达,Western blot证实与GFP-ILK-2融合蛋白大小基本一致的阳性条带；病毒滴度为1×109pfu/ml; RT-PCR检测其对ILK基因表达的敲减效率>80%。3. TGF-β1mRNA及蛋白的表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞TGF-β1mRNA及蛋白表达量均显著增加(P<0.01),其中C组、D组表达量显著低于B组(P<0.01),C组的表达量又显著低于D组(P0.05)。4.
Smad2mRNA表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞Smad2mRNA表达量均显著增加(P<0.01),其中C组、D组、E组表达量显著低于B组(P<0.01),C组的表达量又显著低于D、E组(P<0.05),其中C、D、E组表达量均显著高于B组(P<0.01),D、E组表达量又显著低于C组(P<0.01),C、D组表达增加程度显著低于B组(P0.05),D组表达量显著低于C组(P<0.01)。7.FSP-1mRNA及蛋白的表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞FSP-1mRNA及蛋白表达量均显著增加(P<0.05),C组、D组表达增加程度均显著低于B组(P0.05),D组表达量显著高于C组(P
ZNF580是由本课题组克隆的一种新的人C2H2型锌指蛋白基因，与Krüppel样锌指转录因子（Krüppel-like 一般 以及 factors, Klfs）家族成员类似，具有参与血管的形成和细胞内信号的转导等功能。而eNOS（内皮型一氧化氮合酶）是维持内皮细胞正常功能所必需的，对于血管的舒张具有很重要的意义。本实验旨在探讨ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS中的作用机制。 目的： 以人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926）为体外模型，在转化生长因子TGF-β的作用下，研究人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580表达情况，分析ZNF580基因表达与内皮细胞稳态相关因子eNOS之间的关系，以及ZNF580基因过表达和低表达对eNOS表达的影响，进一步揭示ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS以及维持内皮细胞稳态中的作用。 方法： ①人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养至EA.hy926细胞生长成单层后备用。②利用Lenti-GFP-ZNF580和Lenti-RNAi-ZNF580瞬时转染EA.hy926内皮细胞，获得瞬时过表达和低表达ZNF580的EA.hy926细胞。运用倒置荧光显微镜观察转染效率，定量PCR以及western-blot鉴定转染后ZNF580和eNOS的表达情况。pGL3-control, pGL3-eNOS-Luc和β-gal质粒共转染EA.hy926细胞，单荧光素酶报告试验检测eNOS和ZNF580的变化趋势是否一致。③胰酶消化收集对数生长期EA.