整体试验：建立裸鼠肺癌移植瘤模型,包括A549,H292等多种肺癌。Pt(0506)101尾静脉注射给药,每4天给药1次,共5次。顺铂和卡铂作为阳性对照药。每3天测量小鼠体重及肿瘤体积1次。给药结束后取肿瘤称重,并拍照。 2.离体试验：采用MTT法检测Pt(0506)101对各种肿瘤细胞的体外细胞毒作用,流式细胞仪检测Pt(0506)101作用后的肺癌细胞A549、H292的细胞周期、凋亡率的变化。 3.作用机制研究：1)在肺癌细胞A549、H292中加入不同浓度的Pt(0506)101,并以顺铂和卡铂作为阳性对照药,48h后检测凋亡蛋白以及信号通路相关蛋白表达情况。2)A549细胞中p53基因特异性敲除后,western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。3)JNK抑制剂(SP600125)、p38抑制剂(SB203580)、Erkl/2抑制剂(U0126)以及P13K抑制剂(LY294002)干预A549细胞后,western blot法检测Pt(0506)101诱导表达上升凋亡相关蛋白。4)超声冻融法提取并测定Pt(0506)101作用后A549细胞内GSH水平,并用流式细胞仪进一步检测ROS的表达情况。用抗氧化剂NAC干预后,测定细胞凋亡率。 结果： 1.整体试验结果：Pt(0506)101-30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg呈剂量依赖性地抑制裸鼠A549、H292肺癌移植瘤的生长,且与模型组比较有显著性差异,A549的肿瘤抑制率分别为31.00%、47.03%、64.64%；H292的肿瘤抑制率分别为45.53%、53.79%、65.41%。Pt(0506)101抗肺癌作用略弱于顺铂DDP-6mg/kg,与卡铂CBP-60mg/kg接近。
2.离体试验结果：1)Pt(0506)101对A549、H292、H460等肺癌细胞株的细胞毒作用较强,虽然作用不及顺铂,却明显强于对卡铂。对顺铂耐药株A549/PPD的作用强度较顺铂强；而对正常肺上皮细胞株BEAS-2B,其作用强度比顺铂弱2倍,此外,Pt(0506)101对胃癌MGC-803, Gefitinib LBH589浓度 HGC-27具有很强的抗癌活性,提示Pt(0506)101在抗瘤作用方面有选择性。2)100gM
Pt(0506)101预处理肺癌细胞48h能显著性促进A549,H292和LTEP-A-2三种肺癌细胞发生凋亡**(P
目的：近期我们研究发现既往主要应用于治疗感染中毒性休克、急性肺损伤等感染性炎性疾病的药物乌司他丁在卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠变应性炎症模型中具有免疫调节和抗氧化作用，同时还发现其免疫调节、抗氧化作用与血红素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1密切相关。 乌司他丁(Ulinastatin，UTI）是一种高效广谱的水解酶抑制剂，感染性炎症以中性粒细胞介导为主，而变应性炎症以嗜酸性粒细胞、肥大细胞等免疫细胞介导为主，二者的作用机制截然不同。因此进一步深入明确UTI在变应性炎症中的药理作用机制，为其转化为治疗变应性炎症的辅助用药提供实验室依据。HO-1属于微粒体催化酶，是体内免疫调节和抗氧化的重要调控因子。前期实验我们发现，乌司他丁在体内实验模型中发挥免疫调节、抗氧化作用与HO-1密切相关，乌司他丁是否是通过调控HO-1以及是通过何种信号通路来调控HO-1发挥免疫调节、抗氧化作用的机制需要在体外细胞实验模型中进一步探讨。 肥大细胞是介导变应性炎症的免疫细胞之一，变应性炎症的病理变化主要表现为肥大细胞活化脱颗粒，进而释放大量炎性介质。许多研究证明Th1/Th2细胞因子失衡是气道变态反应性炎症疾病发病机制的主要原因之一。因此实验选取Th2的代表因子IL-4作为刺激因素，它可以刺激B细胞增殖，从而产生大量的IgE抗体，导致肥大细胞活化。因此，本课题选用IL-4刺激肥大细胞活化，建立体外细胞实验模型对乌司他丁发挥免疫调节、抗氧化的药理作用机制进行深入探讨。 方法：肥大细胞（P815细胞株，购买自美国）培养于1640培养基中，其中含有10%新生牛血清,根据实验设计分组：空白对照组（Con组）、IL-4刺激组、乌司他丁干预组（UTI+IL-4组）、Znpp干预组（Znpp+UTI+IL-4组）。通过检测类胰蛋白酶活力及Th1/Th2细胞因子（IL-5、IL-13、TNF-α、INF-γ）水平从免疫调节角度验证乌司他丁是否能够抑制IL-4介导的肥大细胞活化；通过检测活性自由氧（ROS）、蛋白质羟基含量水平、丙二醛（MDA）及抗氧化酶指标：总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、微量还原性谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的水平从氧化应激角度验证乌司他丁是否能够调节IL-4介导的肥大细胞活化引起的氧化/抗氧化失衡；应用血红素加氧酶(Heme
Oxygenase，HO)-1的抑制剂Znpp验证乌司他丁是否通过调节HO-1来发挥免疫调节、抗氧化作用；通过电泳迁移率（EMSA）、WesternBlot等方法检测HO-1的上游调控因子Nrf2及相关信号通路探讨乌司他丁调节HO-1表达的具体机制。 结果： 1IL-4、UTI的最适干预时间和浓度 通过MTT法及类胰蛋白酶活力实验确定IL-4的最适宜浓度及干预时间分别为100ng/ml、6h；通过MTT法及UTI诱导HO-1蛋白水平的表达确定UTI的最适宜浓度及干预时间分别为100U/ml、2h。 2Znpp抑制HO-1在肥大细胞中的表达 肥大细胞在给予HO-1的抑制剂Znpp干预后，HO-1的表达无论是在细胞免疫荧光水平，还是在蛋白表达水平都有明显减弱趋势，差异均具有统计学意义（P﹤0.05）。 selleckchem 3UTI抑制IL-4介导的肥大细胞脱颗粒 IL-4刺激肥大细胞后，类胰蛋白酶活力明显增强，高于空白对照组，差异具有统计学意义（P﹤0.05）；UTI能够明显降低类胰蛋白酶活力，抑制肥大细胞活化状态，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。 4UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的Th1/Th2细胞因子失衡 Th1代表因子IL-5、IL-13、TNF-α的表达在IL-4刺激组明显高于空白对照组，Th2代表因子INF-γ的表达明显低于空白对照组，差异具有统计学意义（P﹤0.05）；UTI明显抑制IL-5、IL-13、TNF-α的表达，提高INF-γ的表达，从而调节IL-4介导肥大细胞活化引起的Th1/Th2细胞因子失衡，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。 5UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的氧化/抗氧化失衡 在空白对照组中，活性自由氧（ROS）、蛋白质羟基含量及丙二醛(MDA)处于低水平；给予IL-4刺激后，三个氧化应激损伤指标表达明显升高，差异具有统计学意义（P﹤0.05），抗氧化酶（T-AOC、SOD、CAT、GSH、GSH-Px）水平明显下调，差异具有统计学意义（P﹤0.05）；当给予UTI干预后，ROS、蛋白质羟基含量及MDA水平明显降低，差异具有统计学意义（P﹤0.