0对结果进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用q检验。
结果: 1、SHG-44细胞株在DMEM培养液中生长良好,在倒置显微镜下可见细胞呈长梭形,核异形性常见。细胞的冻存与复苏对细胞生物学特性没有影响。加入他莫昔芬后,细胞折光性变弱,轮廓增强,突起减少,胞质中出现大量颗粒,细胞之间的间隙明显增大,细胞变老,脱落,生长受到抑制。正常对照细胞生长良好。2、加入PKCα抗体的SHG-44细胞的细胞质中出现棕黄色染色,提示细胞中含有PKC,而加入ER抗体的细胞中未出现染色,提示SHG-44细胞中无ER成分。3、MTT试验显示:应用不同浓度他莫昔芬作用后测量各培养孔的吸光值,与空白对照组相比,他莫昔芬使细胞的吸光值明显下降。再计算细胞的抑制率,结果显示,随着他莫昔芬从2μmol/L上升至10μmol/L,SHG-44细胞的抑制率也明显增加,但超过10μmol/L,则抑制率的变化就不够显著。同一药物浓度下,48h组的细胞抑制率明显高于24h组,但与48h组相比较,在72h组中只有6μmol/L组的抑制率增加了。4、流式细胞仪检测显示:与空白对照组相比,SHG-44细胞经过他莫昔芬作用后,G0/G1期细胞比例减少,G2/M期及S期细胞比例增多,细胞阻滞于G2/M期及S期。细胞凋亡检测显示:与空白对照相比,应用他莫昔芬组凋亡细胞比例增高,并且随着作用剂量的增加,凋亡细胞比例有增多的趋势。 GSK1120212半抑制浓度 第二部分SHG-44人胶质瘤细胞离子通道特性及他莫昔芬调控研究 方法:1、培养SHG-44胶质瘤细胞,试验前,以0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA消化,制成细胞悬液,接种于预先放置盖玻片含无血清培养基的培养板中,经过48小时后可进行膜片钳记录。应用全细胞膜片钳方式记录SHG-44细胞膜上的钠通道、内向整流钾通道及氯离子通道电流,细胞破膜后5min开始记录。2、绘制各离子通道的电流密度–电压关系(I–V)曲线。观察施用不同浓度他莫昔芬后各离子通道的I-V曲线及峰值电流密度的变化。3、以I/Imax为纵坐标,以他莫昔芬浓度为横坐标,绘制各通道药物作用的量效关系散点图,以Origin 7.5软件行Hill拟合,求出他莫昔芬抑制各离子通道的半数抑制浓度(IC50)值。4、以标准化后的电导值对测试电压脉冲作图。以Origin 7.5软件行Boltzmann拟合,绘出对照组及各处理组钠、钾、氯通道的激活曲线,求出通道的半数激活电压(V1/2)及斜率(k)值,并观察不同浓度的他莫昔芬对它们的影响。5、比较空白组及加入他莫昔芬、PKC抑制剂、PKC激活剂、他莫昔芬+PKC抑制剂各处理组之间的氯离子通道电流变化情况,以分析他莫昔芬对通道的影响是否与抑制PKC活性有关及其程度。他莫昔芬浓度为1.5μmol/L 可能 ,PKC抑制剂为100nmol/L十字孢碱(staurosporine),PKC激活剂为1μmol/L 12-佛波醇脂(PMA)。6、应用SPSS 12软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,首先进行组间均衡性检验,两组计量资料采用t检验或配对t检验,成组资料间比较采用配伍组分析,以P
目的: 1.研究月经周期不同时期人输卵管黏膜上皮维生素D受体(vitamin
D receptor,VDR)蛋白及其mRNA的表达与变化,阐明人输卵管组织中是否存在VDR表达及其表达状况。 2.检测输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达及其变化,分析人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达与输卵管妊娠发病的可能关系。 3.体外培养人输卵管上皮细胞,观察1α,25-二羟维生素D_3(1α,25-dihydroxyvitamin D_3,1α,25-(OH)_2D_3)对人输卵管上皮细胞增殖的影响。
4.检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、钙结合蛋白calbindin-D28k(CaBP-D28k)mRNA及其蛋白表达的影响,分析1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k表达可能的调控作用,探讨1α,25-(OH)_2D_3调节人输卵管上皮细胞CaBP-D28k表达可能的作用机制。 方法: 1.应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法和逆转录聚合酶链反应(reversetranscription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及其mRNA的表达。 2.应用IHC法检测输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达。 3.应用机械法结合差速贴壁原理获取并体外培养人输卵管上皮细胞,免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法鉴定上皮细胞纯度,建立人输卵管上皮细胞的体外培养体系。应用噻唑兰(3.(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium AZD4547浓度 bromide,MTT)比色法检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞增殖的影响。 4.应用RT-PCR法和免疫印迹(Western blot,WB)法检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA及其蛋白表达的影响。 结果: 1.人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及VDR mRNA的表达 人输卵管黏膜上皮可检测到VDR蛋白及其mRNA表达。VDR蛋白主要表达于人输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。相同时期各不同部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达无明显差别(P＞0.05),随月经周期变化,各不同部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达发生改变,在增生早期和分泌中晚期较低,与之比较,在增生中晚期和分泌早期其表达明显增高(P＜0.01),至分泌早期达最高值。壶腹部人输卵管黏膜上皮组织VDR mRNA表达在增生早期和分泌中晚期较低,在增生中晚期和分泌早期明显增高(P＜0.01)。 2.输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达 输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮均可检测到VDR蛋白阳性表达。VDR蛋白阳性表达于输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。种植部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达较低,与之比较,非种植部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达明显增高(P=0.017,P＜0.05)。 3.