5μM6-溴靛玉红-3-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime，BIO）（GSK3β信号通路抑制剂），分离得到了2株来源于昆白小鼠体外受精囊胚的ESCs系。在这个培养体系中，体外受精来源的扩张囊胚可以自发孵化并贴壁。培养过程中，可以观察到类胚胎干细胞集落，经过扩增，得到了2株昆白小鼠ESCs系，分别命名为KMES1和KMES2。这2株细胞系和其他啮齿类动物的ESCs具有相同的形态学特征，具有碱性磷酸酶活性，具有与细胞多能性相关的细胞标记，包括Oct-4, Nanog和SSEA-1。拟胚体实验和畸胎瘤实验证明分离得到的ESCs可以在体内外自发分化为三胚层来源的细胞。 （2）对关中奶山羊进行超数排卵和配种，手术法采集体内发育囊胚。在添加有2.5μM BIO、0.5μM PD184352（MEK信号通路抑制剂）、0.5μM SB431542（ALK5抑制剂）和1000U/mL白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的“3i”体系中分离培养ESCs。共超排了118只关中奶山羊，获得1204枚囊胚，分析表明，季节和气温变化会影响关中奶山羊的超排效果，秋冬季超排处理期间气温骤降会显著降低超排羊的胚胎回收数。通过机械分割法将超排获得的囊胚内细胞团分离后接种于铺有饲养层细胞的四孔板，在“3i”培养体系中培养，分离得到了山羊类ESCs，并传至12代，类ESCs具有碱性磷酸酶活性、表达OCT-4和Nanog，经悬浮培养可形成拟胚体，拟胚体贴壁培养后可自发分化为神经样细胞。
Stem Cells 抑制剂 研究结果证明，添加有BIO培养体系可以支持无饲养层、无血清条件下小鼠ESCs的建系；在添加有BIO，SB431542和PD184352三种小分子化合物的培养体系中，可以分离得到山羊类ESCs，这为加快良种山羊的育种速度提供重要的技术平台。
将外源多能转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)介导成体干细胞，诱导得到多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，其具有与ES (embryonic stem)细胞相同的特性，不涉及胚胎伦理问题。近年，iPSCs技术发展迅猛，成为生命科学研究及临床应用的热点研究领域。 国内外多家实验室成功地将猪体细胞诱导为iPSCs。但不同实验室得到的猪iPSCs，由于采用的方法和培养条件不同，使其表观遗传特性存在差异。重编程过程需要高滴度的和一定化学剂量的转录因子表达，诱导时4个转录因子随机整合，形成的iPSCs通常拥有不同的拷贝数。这种病毒载体随机拷贝插入和重编程的随机性，给研究细胞重编程机制和利用小分子替代转录因子的研究带来了困难。本实验将携带4个鼠源多能转录因子的慢病毒载体TetO-FUW-OSKM和辅助载体FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embryonic Fibroblasts，PEF)，将串联的四因子整合到体细胞基因组中，在添加Dox
(deoxycycline)的多能细胞培养条件下形成iPSCs，称其为一代iPSCs。随后，将第一代iPSCs再分化为成纤维样细胞，称其为TetO-PEF。 TetO-PEF含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA，无需再导入质粒，可在添加Dox的条件下外源整合的四因子被激活，启动细胞重编程，高效率的获得iPSCs。本研究建立的TetO-PEF细胞系，解决了四因子拷贝数不均一的问题，为研究猪重编程机制、猪iPSCs培养条件优化、小分子化合物诱导重编程等研究提供了新的实验平台。主要获得了以下结果：
不 1.建立TetO诱导重编程一代细胞系 本实验成功分离了猪胎儿成纤维细胞。并将TetO诱导表达系统质粒TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA包装成病毒，感染PEF细胞，在添加Dox的iPSCs条件培养条件下重编程为一代iPSCs。第一代iPSCs，AP染色呈阳性，且能在无血清培养条件下正常传代。经PCR、RT-PCR检测，证实外源基因成功整合基因组且外源四因子正常表达。 BMS-907351购买 2.建立直接诱导TetO第二代成纤维细胞重编程为二代iPSCs的体系 本研究通过将第一代iPSCs形成EB (Embryoid Body, EB)并将其定向分化为成纤维细胞，获得了含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA质粒的TetO-PEF。由于一代iPSCs基因型一致，由此分化得到的TetO-PEF具有一致的基因型。TetO-PEF在Dox培养条件下可以快速形成二代iPSCs。经免疫荧光染色检测，二代iPSCs高表达OCT4、SOX2、SSEA-1、TRA-1-60，弱表达SSEA-4，而不表达TRA-1-81。
肝纤维化是指由慢性炎症导致的肝组织结构变化及大量纤维瘢痕的形成，进一步可发展为肝硬化及肝癌，目前无有效药物，因此，研究抗肝纤维化药物具有现实意义。本课题通过体外细胞模型从6种药食用真菌液态发酵菌粉中筛选抗肝纤维化的化合物，并研究其抗肝纤维化的作用机制，为未来研究抗肝纤维化药物提供初步的理论依据。 本论文以TGF-β1活化的肝星状细胞CFSC-8B为研究对象，通过天狼猩红染色方法检测胶原含量，构建肝纤维化细胞模型。结果表明10ng/mLTGF-β1作用CFSC-8B48h，染色液体积200μL为最佳的建模条件；利用SB431542和Silybin两个阳性药物及其它11种具有抗肝纤维化活性的化合物及蛋白质因子验证了此方法的可靠性；进而利用这一细胞筛选模型以抗肝纤维化活性为导向，通过硅胶色谱及HPLC进行分离纯化，利用紫外、质谱及核磁等技术，并和已有文献比对，从樟芝菌粉中分离并鉴定了两个单体化合物Antrodin A和Antrodin B。天狼猩红染色结果表明Antrodin B可显著抑制TGF-β1诱导的胶原生成，且具有剂量依赖性。 为进一步阐明Antrodin B抗肝纤维化的作用机制，本课题使用MTT、WST-1、细胞划痕、细胞小室迁移、荧光定量PCR、蛋白质印迹等方法，分别进行了细胞活性、细胞增殖、细胞迁移、肝纤维化相关基因及信号通路中蛋白表达情况的研究，结果表明：Antrodin B与CFSC-8B共孵育48h的IC50值为59.