SIK1在糖尿病肾病大鼠肾脏的表达和意义 将SPF级8周龄wistar大鼠随机分为正常对照组(normal组,10只)和糖尿病组(diabetic组,20只)。糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ,溶于pH值4.5的0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,60mg/kg),对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后尾尖取血,血糖≥16.7mmol/L者确定为1型糖尿病模型。于12和16周龄糖尿病模型组取5只大鼠,乙醚麻醉大鼠,眼球内眦取血,离心分离血清,用于测定血糖；称重后于腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠麻醉,分离肾脏。于20周龄,将各组大鼠于代谢笼中,监测24h尿量,尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)水平,并计算内生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)。麻醉取血,分离血清测定血糖,血肌酐及尿素氮水平。摘取肾脏,称重,计算肾脏指数。取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,用于HE,

PAS染色观察其病理变化情况。 取肾组织制备切片进行免疫组化。分别提取肾组织及肾小球组织蛋白,应用免疫沉淀及Western blot方法以及观察糖尿病大鼠肾脏SIK1蛋白表达及磷酸化水平的影响。并应用Western blot方法观察20周龄大鼠肾小球ALK、FN. PAI-1表达情况,Masson染色观察20周龄大鼠肾小球胶原纤维及ECM聚集情况。 2.高糖刺激对系膜细胞SIK1的表达、活性、细胞内分布及ALK5信号通路的影响,SIK1表达质粒对高糖刺激下的系膜细胞ALK5信号通路及系膜细胞增殖的影响 很少 大鼠肾系膜细胞HBZY-1细胞以含有10%胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,用高糖(30mmol/L, 所以 High glucose, HG)制备模型,于刺激后0、12、24和48h收集细胞,免疫沉淀、Western

blot及半定量RT-PCR分别检测SIK1表达及磷酸化水平。构建pEGFP-SIK1表达质粒,激光共聚焦观察高糖刺激下细胞内生性及转染pEGFP空质粒及pEGFP-SIK1表达质粒后SIKl细胞内分布及核转运情况。Western blot及免疫细胞化学观察高糖对HBZY-1细胞ALK5信号通路的影响。 设计和构建针对SIK1基因的表达质粒,将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,同步化后将细胞随机分为3组,空白细胞对照组、pCDF1空质粒对照组和pCDF1-SIK1质粒转染组,24h后细胞长至70-80%时开始转染,转染采用阳离子脂质体法。48h后荧光显微镜观察转染效率,终止培养进行蛋白、RNA提取。Western blot及半定量RT-PCR检测细胞内SIK-1蛋白和mRNA的表达。对各组转染成功细胞以高糖继续培养48h,终止培养后以Western blot及细胞免疫组化检测SIK1、ALK5、FN及PAI-1表达,MTT法检测细胞增殖情况。 [结果] 1.SIK1在糖尿病肾病大鼠肾脏的表达和意义 (1) wistar大鼠腹腔注射STZ成功建立1型糖尿病模型。与正常对照组比较,模型组表现出多饮、多食及体重减轻的特点。20周龄时,模型组餐后血糖水平升高,但血甘油三酯及胆固醇水平正常。与正常对照组相比,模型组出现糖尿病肾病的明显特征,各肾功能指标均表现出显著性差异。糖尿病模型组24h尿量、肾体重比、尿白蛋白分泌率、血肌酐,肌酐清除率,血尿素氮指标水平均明显升高,并出现肾小球肥大、纤维化,基底膜增厚等病理改变,肾小球面积及系膜增殖指数明显增大。 (2)免疫组织化学检测发现,SIK1在正常大鼠肾脏的肾小球及远曲小管表达明显,在近曲小管表达较少,且在各细胞的胞浆无着色,胞核无着色。在糖尿病模型组大鼠中,SIKl在肾小管的表达与正常对照组一致。而在肾小球的随病程月数的增加,SIK1的表达依次减少,呈时间依赖性。Western

blot检测发现,在糖尿病大鼠肾组织SIK1的表达在三个时间点无明显变化,与正常对照组大鼠20周龄一致。而肾组织SIK1磷酸化水平在三个时间点却依次减少,且均明显低于正常对照组大鼠20周龄肾组织SIK1磷酸化水平。分离肾小球提取蛋白发现,糖尿病大鼠肾小球SIK1的表达在三个时间点表达却依次减少,均明显低于正常对照组大鼠20周龄肾小球SIK1的表达。 还有 (3)与正常对照组大鼠相比,Western blot检测发现20周龄糖尿病大鼠肾小球ALK5、FN、PAI-1表达明显增高,Masson染色观察发现糖尿病大鼠肾小球肾小球胶原纤维及ECM明显聚集。 2.高糖刺激对系膜细胞SIKl的表达、活性、细胞内分布及ALK5信号通路的影响,SIK1表达质粒对高糖刺激下的系膜细胞ALK5信号通路及系膜细胞增殖的影响 (1)高糖刺激后0、12、24、48h,经免疫沉淀及Western blot检测发现,SIK1的表达及磷酸化水平依次递减,呈时间依赖性,有统计学意义。细胞免疫荧光后激光共聚焦观察发现SIK1在HBZY-1细胞的核内外均匀表达,高糖刺激下表达减少并向细胞内转运。转染pEGFP-SIKl表达质粒后,激光共聚焦观察发现GFP荧光信号在高糖刺激下由核外向核内转移。 (2)高糖刺激后0、12、24、48h,经Western blot检测发现,ALK5、FN、PAI-1表达水平依次递增,呈时间依赖性,有统计学意义。相对于高糖刺激后0h,细胞免疫组化发现在高糖刺激48h后FN、PAI-1表达水平明显增高。 (3)经酶切鉴定和测序分析,质粒符合设计要求,命名为pCDF1-SIK1。转染HBZY-1细胞24h后荧光倒置显微镜可见绿色荧光蛋白表达,48h表达量达60%以上。相对于正常对照组及pCDFl空质粒对照组,半定量RT-PCR及Western blot检测提示pCDFl-SIK组mRNA水平分别增加1.81和1.86倍,蛋白水平分别增加1.81和2.06,继续高糖刺激48h后,Western blot检测提示pCDF1-SIK组ALK5蛋白水平降低37.