7巨噬细胞表面受体CD14、胞内信号转导分子p38 MAPK、iNOS及炎症介质TNF-α、NO表达的动态变化,探讨槐定碱抗内毒素性炎症反应的机制。 方法用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,建立细胞炎症反应模型,实验细胞分为8组(n = 6):空白对照组、LPS模型1组、LPS模型2组、槐定碱干预组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组、SB203580组、SB203580
+槐定碱干预组。槐定碱剂量15.63 mg·L~(-1)。MTT法测定槐定碱最大无毒浓度(TC0);反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38及iNOS mRNA表达;Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p-p38及iNOS蛋白的表达;硝酸还原酶法测定细胞培养液一氧化氮(NO)含量;放射免疫分析法检测细胞培养液肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。 没有 结果( 1)Reed Muench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0=200 mg·L~(-1)。(2)与空白对照组比较,LPS模型1组各时间点CD14、p38、iNOS mRNA与CD14、p-p38、iNOS蛋白表达均显著增高(P<0.01或P<0.05),但仍高于空白对照组(P<0.05或P<0.05或P<0.01或P<0.05),但仍高于空白对照组(P<0.01或P<0.05),但均高于空白对照组(P<0.01);与LPS1组比较,槐定碱干预组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组(P<0.05或P0.05); SB203580组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组(P<0.05或P<0.01);SB203580+槐定碱干预组NO、TNF-α释放量多低于同时间点SB203580组(P<0.05或P0.05),表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有时间依赖性。 (5)与LPS1组比较,槐定碱31.25 mg·L~(-1)、15.63 mg·L~(-1)剂量干预组均可下调NO、TNF-α释放量(P<0.05或P0.05);SB203580组NO、TNF-α释放量均低于LPS1组(P<0.05或P0.05);表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有剂量依赖性。 已经 结论(1)Reed Meuench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0= 200mg·L~(-1)。 (2)槐定碱抗内毒素效应与其下调LPS诱导的CD14、p38、iNOS的转录、翻译及蛋白磷酸化水平及直接拮抗内毒素作用有关。
(3)槐定碱抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO、TNF-α的效应具有时间依赖性和剂量依赖性。 (4)槐定碱可协同SB203580抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS的表达及NO、TNF-α的释放,表明槐定碱还可通过干预p38 MAPK途径外的其它信号通路抑制LPS诱导的炎症因子表达。
目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素，其污染非常普遍，在粮食作物和食品中存在非常广泛。OTA的主要毒性作用器官是肾脏，OTA可能是巴尔干地方性肾病的主要致病原，1993年国际癌症研究中心IARC将OTA列为“可能的人类致癌物”。除外肾毒性，动物实验研究还发现OTA具有免疫毒性、肝毒性、神经毒性、致突变性、致畸性和致癌性等生物效应。长期食用OTA污染的饲料，可以诱发F344/N大鼠出现前胃上皮细胞增生和乳腺纤维腺瘤。由于在食物中分布的广泛性，人类很容易长期暴露于OTA的毒性环境中。 研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通过引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滞，比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素B1。我们实验室前期研究工作发现，OTA通过下调人胃黏膜上皮细胞周期调控关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达引起细胞G2期阻滞，提示OTA可通过G2期阻滞来发挥其部分毒性作用，在中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）及非洲绿猴肾脏细胞（CV-1）中，OTA也通过导致G2期阻滞来发挥其毒性作用。
丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联是细胞内重要的信号转导系统之一，参与细胞的各种生理及病理活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK（细胞外信号调节激酶）通路，JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶）通路和p38MAPK通路。研究表明在各种刺激因素的作用下，细胞可以通过激活或抑制MAPK信号通路而启动细胞G2期检测点，使细胞发生G2期阻滞。Yang等人发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇介导的G2/M阻滞是通过ERK1/2信号通路增强p_21水平实现的。然而，目前有关OTA诱导人胃黏膜上皮细胞G2阻滞的相关分子机制尚不明了。 那个 鉴于MAPK信号通路在细胞周期中的重要作用，我们提出这样的假设，即MAPK信号通路可能参与OTA诱导的人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。为验证本假设，本实验将观察JNK、ERK和p38MAPK信号通路在OTA诱导的G2期阻滞中的作用，以期揭示OTA诱导体外人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞的可能分子机制。 方法： 1细胞培养与处理 正常人胃黏膜上皮细胞（GES-1）培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养，细胞贴壁生长。 选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予OTA，使其终浓度分别为5、10、20μM，溶剂对照组给予终浓度为0.