为了上调和下调WISP-2或PPARγ的表达,用携带质粒为WISP-2或PPARγ的过表达(OE)或敲除(shRNA)的慢病毒转染培养的软骨细胞。72小时后,收集细胞进行后续实验。为探讨WISP-2对细胞凋亡的影响,对转染了WISP-2shRNAs的软骨细胞在转染72h后进行了200μg/ml的AGE处理以诱导凋亡。2.5 RT-qPCR从软骨细胞中提取总RNA,反转录成cDNA。RT-q点击此处PCR引物序列见文中表1。扩增条件为扩增条件为首先在94℃保温5min,然后在94℃保温10s/60℃保温20s/72℃保温30s模式下进行40次循环,72℃保温2.5min,40℃保温1.5min,从60℃融化至94℃,1℃/s,mRNA水平归一为β-actin,用2-ΔΔCt法计算相对mRNA水平。2.6蛋白印迹(Western blot)Western bl并且ot检测WISP-2、PPARγ、Zfp423和凋亡相关蛋白的蛋白水平。用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。通过凝胶电泳分离等量蛋白质,用ECL底物检测靶条带。利用凝胶图像处理系统(gel-Pro分析仪软件)分析谱带的光密度。2.7 TUNEL检测;免疫荧光;MTT检测;(Annexin V&PI)双染色法流式细胞术;HoechstC188-9细胞系染色。按常规实验方法进行,论文中有详细步骤。结果1基因芯片结果发现髋关节软骨上调基因共246个。其中104个上调基因中的8个和142个下调基因中的8个被列为研究对象。WISP-2和PPARγ在DDH的早期表达变化提示WISP-2和PPARγ可能是DDH启动的重要因素。2番红O染色及大体测量及检测第8天的DDH组幼鼠髋臼和股骨头的大小明显减小,表现为浅髋臼,髋臼和股骨头的长轴和短轴均变短。番红O染色显示髋臼及股骨头软骨退化表现,细胞凋亡显著增加。