然而,RAD6B在结肠癌在内的多种肿瘤中异常表达,其在肿瘤增殖及转移中的作用尚待阐明。通过项目研究,拟阐明RAD6B调控结肠癌转移的具体机制,为临床结肠癌的治疗以及分子标志物的研发提供新的靶点和理论基础,助力结肠癌精准医疗的开展。方法为研究RAD6A或/和RAD6B敲除后,细胞内基因表达水平的改变,首先在293T细胞中,利用CRISPselleck激酶抑制剂R-Cas9技术敲除RAD6A或/和RAD6B基因,筛选稳定株后通过PrimeView基因表达阵列(GeneChip)检测差异表达基因。经IPA通路分析筛选RAD6A或/和RAD6B敲除引起显著变化的通路。针对癌症基因图谱(TCGA)数据库结肠癌病例以及正常对照样本的转录本分析,明确RAD6B在不同年龄、性别Selleckchem JQ1、体重以及TNM分期病例中的表达水平;通过对包含45例结肠癌样本以及对应癌旁组织的组织芯片的免疫组织化学染色,进一步从蛋白水平检测RAD6B的表达水平。利用针对RAD6B基因的siRNA慢病毒载体以及过表达质粒,分别获得RAD6B敲低或者过表达的结肠癌细胞系。通过CCK-8以及流式细胞术等方法,首先检测RADselleck化学药品6B在结肠癌细胞增殖中的作用;又通过划痕实验以及Transwell实验,研究RAD6B抑制或者过表达对于结肠癌细胞系迁移以及侵袭的影响。建立不同动物模型,包括皮下移植瘤模型以及通过尾静脉注射和脾脏注射的体内转移模型,充分验证RAD6B基因对结肠癌生长和转移的促进作用。对于机制研究,通过细胞形态观察、免疫荧光以及全自动蛋白质表达定量分析Wes等方法研究RAD6B对于结肠癌细胞EMT的作用。