61±0.57%和2±0.22%。通过CFCs (cloning forming cells)检测发现Rapamycin对于粒-巨细胞形成集落,爆式红细胞集落的生成没有显著的影响。对衰老表型的研究发现,在未扩增的对照的细胞中,我们几乎没有发现衰老的细胞,细胞在Veh的处理下,扩增了10天以后,Lin-Sca-1+细胞出现了9.7±1.95%的衰老细胞,但是Rapamycin非常明显的抑制了衰老细胞出现的频率,为2.4±0.71%。对自噬的研究发现,经过Rapamycin处理以后,自噬标志性分子LC3b的表达面积显著低于Veh组,甚至比未扩增的细胞还要低；对细胞周期的研究发现,Rapamycin处理显著的增加了G0期细胞的比例,Veh组的G0期细胞的比例为11.75±3.3%,Rapamycin组的G0期细胞的比例为21.7±3.5%。不仅如此,Rapamycin的处理还减低了p16和p53的表达。 所以 结论：抑制mTORCl活性并没有影响造血干细胞的凋亡和分化,而显著降低了其在扩增过程中出现的衰老。Rapamycin并没有通过增强自噬来抑制衰老,而是通过调节了一系列的细胞周期动力因子和阻滞因子实现了对衰老的抑制。
第四部分mTORCl和p38 MAPKα在造血干细胞体外扩增过程中的相互对话关系 目的：在我们以前的研究中发现了抑制p38 MPKα的活性可以通过抑制衰老促进造血干细胞的体外扩增,而在这里我们发现了抑制mTORCl的活性也是主要通过抑制衰老的作用而促进了造血干细胞的体外扩增,那么两者的关系究竟如何呢?在这部分的研究当中我们对mTORCl和p38 MAPKα相互对话关系进行了深入的探讨和研究。 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞,应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞,应用Rapamycin作为mTORCl抑制剂,SB(SB203580)作为p38 MAPKα的抑制剂,以DMSO作为对照。扩增10天,SB从第一天开始加,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集扩增后细胞。通过免疫印迹,免疫荧光,聚合酶链式反应等方法检测相关分子表达情况。 结果：在造血干细胞体外扩增过程当中,抑制mTORCl对p38 MAPKα没有影响,但是抑制p38
MAPKα活性会反而增强mTORCl的活性。联合抑制mTORCl和p38 MAPKα可以进一步促进造血干细胞的体外扩增。四组比较发现,Veh组获得了1.5±0.3×103,Rapamycin组获得了1.9±0.1×103,SB组获得了2.2±0.2×103,联合处理组获得了2.6±0.14×103的LSK+细胞,以及更多的day35 CAFCs,分别为3.4±0.57,7.8±0.32,9.7±0.21,11.4±0.63/100,000个扩增细胞。联合抑制mTORCl和p38 MAPKα,通过对SA-β-gal的研究发现SB和Rapamycin的联合应用明显的进一步降低了衰老表型的表达,只有1.9±0.7%,而单独加入Rapamycin或者SB则有4.3±2.1%,5.2±1.6%,联合抑制以后p16和p53的表达进一步降低,只有Veh组的0.37±0.05,0.45±0.08倍。 结论：在造血干细胞过程中抑制mTORCl对p38 而且 MAPK a活性没有影响,而抑制p38 MAPKα活性会进一步激活mTORCl,同时抑制两条通路可以通过增强抑制衰老达到进一步促进造血干细胞扩增的目的。
疾病的发生发展几乎总是引起不同程度的疼痛发生。尽管已有多种药物和方法可用来进行疼痛治疗,但其效果并不理想。因此寻求新的疼痛调节因子并进行干预治疗具有重要的临床意义。伤害性刺激或神经损伤诱导的炎症免疫反应与疼痛发生发展关系密切。MIF是参与几乎所有炎症性疾病过程的促炎性细胞因子,有研究提示MIF是神经损伤后再生与功能恢复的重要参与者。鉴于神经损伤与疼痛之间的因果联系,推测MIF可能在疼痛发生发展过程起着敏化神经及降低痛阈的作用。
CYC202浓度 本研究通过建立急性炎症性疼痛和慢性神经病理性疼痛模型,鞘内给药MIF互变异构酶小分子抑制剂ISO-1观察疼痛阈值变化与脊髓MIF水平之间的关系,进而分析MIF介导疼痛病理发生的可能信号活化机制。这为疼痛治疗潜在干预靶点提供线索,并为MIF相关疼痛药物的开发提供理论基础。整个研究分为如下三个部分： 一.MIF参与福尔马林诱导急性炎症性疼痛阈值的调节及其机制 通过福尔马林诱导炎症性疼痛模型大鼠鞘内给药不同剂量MIF小分子抑制剂ISO-1,发现福尔马林诱导的二相疼痛行为学改善呈现ISO-1剂量依赖性变化。伴随着福尔马林诱导疼痛行为学变化,大鼠脊髓背角MIF及其受体CD74蛋白表达呈现时间依赖性上调特征；同时脑脊液MIF水平在福尔马林注射后第二时相后期显著增加；而ISO-1的应用使得脊髓背角MIF及CD74表达下调,这说明脊髓MIF水平的变化参与福尔马林诱导炎症性疼痛的发生发展。在此基础上,应用蛋白印迹技术发现ISO-1可以显·著抑制ERK、p-p38 MAPK及NR2B表达；而ERK与p38 MAPK抑制剂又可显著下调NR2B蛋白表达,这说明ERK-p38 MAPK-NR2B信号通路的活化参与了MIF介导福尔马林诱导炎症性疼痛的病理发生过程。进一步地,通过免疫组化方法检测了脊髓背角MIF、CD11b、CD3的表达变化,结果发现MIF与CD11b共表达于脊髓背角,这说明福尔马林诱导炎症性疼痛大鼠脊髓背角MIF高表达来源于脊髓小胶质细胞。为了证明抑制MIF互变异构酶活性与抑制其生物活性等效,即鞘内ISO-1的应用是否有效抑制MIF生物活性,本研究以多巴铬甲酯为互变异构酶活性检测工具,进行了MIF互变异构酶活性与MIF生成之间的相关性观察,结果显示ISO-1抑制MIF互变异构酶活性的作用与抑制MIF生成的作用一致,从而证明选择MIF互变异构酶小分子抑制剂作为MIF相关性疼痛治疗与药物开发切实可行。 二.