99±2.279ng/ml升高到38.671±1.374ng/ml，具有显著差异（P<0.05)；与对照组相比，红景天苷组大鼠无明显差异(P＞0.05)；与急性力竭组相比，红景天苷用药力竭组由0.633±0.087升高到0.967±0.0788，存在显著性差异(P<0.05)；与对照组相比，红景天苷组大鼠无明显差异(P＞0.05)；与急性力竭组相比，红景天苷用药力竭组由1.050±0.091下降到0.770±0.070，存在显著性差异(P
目的：糖尿病（diabetes

mellitus，DM）是一种无法治愈的慢性疾病。目前全球糖尿病的患病率逐年升高，其慢性大血管并发症包括高血压、冠心病、脑血管疾病及周围血管疾病，是糖尿病患者的主要健康威胁，尤其是心血管疾病已经成为糖尿病患者发病率和致死率最高、危害最大的慢性并发症之一。糖尿病大血管病变的主要病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）。在高糖、炎症因子等刺激下，血管平滑肌细胞（vascular SB431542临床试验 smooth muscle cells，VSMCs）激活，发生表型转化，由收缩型转化成合成型，迁移至内膜下层并大量增殖，是AS发生的关键环节。此外，高糖可促进血管内皮细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，如NADPH氧化酶(nicotinamide vadenine dinucleotide phosphateoxidase，NOX)、黄嘌呤氧化酶、线粒体呼吸链酶复合体、内皮型一氧化氮合酶及脂氧合酶等，其中NADPH氧化酶是血管内皮细胞ROS的主要来源，NADPH氧化酶是由p47phox、p67phox、p40phox、小G蛋白Rac1或Rac2五个亚基组成的酶复合体，其中p47是NADPH氧化酶的关键亚基，NADPH氧化酶亚单位表达及活性的改变在AS中扮演着重要角色。

selleck Kinase 抑制剂 Library 白藜芦醇（Resveratrol，Res）因其多重生物活性倍受关注。白藜芦醇化学名称为3，4′，5-三羟基二苯乙烯(trans-3,4′,5-trihybdroxystilbene)，是一种天然的多酚类化合物，存在于多种中草药和其他植物中。诸多研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降低血糖、减少血小板聚集、促进血管舒张、心血管保护以及对抗2型糖尿病及其相关并发症等作用。此外，白藜芦醇还可干预体外高糖培养的大鼠VSMCs的异常增殖。有报道称，Res能减弱高糖培养的大鼠VSMCs的异常增殖，其在一定程度上与SIRT1（NAD+依赖的去乙酰化酶）的表达相关。Res是目前最强的SIRT1的天然激活物，但白藜芦醇对于SIRT1及其相关信号通路在抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖作用的机制尚不明确。本实验以高糖诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞为研究对象，探讨白藜芦醇对VSMCs增殖活性的影响及其潜在作用靶点沉默信息调节子（SIRT1）抑制细胞内NADPH氧化酶-p47蛋白生成通路的作用，为防治糖尿病及其并发症提供新的理论依据。 方法： 1细胞培养的方法如下：用大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5(细胞株购自中国培养物典藏中心)作为研究对象。将冻存的血管平滑肌细胞株立刻投入37℃温水中，同时摇动冻存管使其快速解冻，解冻后以800转/min离心5min，弃上清，加入含20%FBS的DMEM培养基5ml并混匀，接种于培养瓶中，放置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育，待细胞铺满瓶底的90%时进行传代。取处于对数生长期的细胞分别接种在50ml培养瓶和96孔培养板上，培养24小时后，再更换为无血清DMEM培养基继续培养24小时，让细胞处于饥饿状态且同步于G0/Gl期，然后分8组进行实验：

PLX4032分子重量 ①正常对照组（control组）：5.5mmol/L葡萄糖 ②高糖培养组（25G组）：25mmol/L葡萄糖 ③高糖+SIRT1抑制剂组（25G+Sirtionl组）：25mmol/L葡萄糖+50μmol/L Sirtionl ④高糖+NADPH氧化酶抑制剂组（25G+Apocynin组）：25mmol/L葡萄糖+1mmol/LApocynin ⑤甘露醇对照组（Mannitol组）：5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇 ⑥高糖+25R组（25G+25Res组）：25mmol/L葡萄糖+25μmol/L白藜芦醇 ⑦高糖+50R组（25G+50Res组）：25mmol/L葡萄糖+50μmol/L白藜芦醇 ⑧高糖+100R组（25G+100Res组）：25mmol/L葡萄糖+100μmol/L白藜芦醇 2采用MTT法检测高糖孵育下，不同浓度Res对VSMCs增殖活性的影响。 3采用流式细胞技术检测高糖孵育下，不同浓度Res对VSMCs细胞周期进程的影响。 4采用Western blot技术检测不同浓度Res对高糖孵育下VSMCs细胞SIRT1、NADPH氧化酶-p47蛋白表达的影响。 结果: 1采用MTT法检测VSMCs的增殖活性，结果显示：在高糖诱导下，VSMCs增殖显著（P＜0.05），而对高渗组细胞的增殖活性无明显影响；Res（25、50、100μmol/L）可显著抑制高浓度葡萄糖诱导的VSMCs增殖（P＜0.05），并呈浓度依赖性。 2采用流式细胞仪检测细胞周期时相分布情况，结果显示：高糖（25mmol/L）能够显著诱导G0/G1期细胞向S期的转化（P＜0.

43%，mp：52~54℃。终产品经质谱、核磁验证为目的产物。 2、最佳的反应条件如下： （1）2,6-二羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶在三氯氧磷条件下合成6-氯-2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶。讨论了反应温度，反应时间，碱等对反应的影响。确定2,6-二羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶(2)氯代的最佳的反应条件是：2,6-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶：三氯氧磷：三乙胺的摩尔比是1:10:2，反应温度65℃，反应时间19h，产率：82.2%。 （2）6-氯-2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶在10%钯碳以及缚酸剂的条件下，合成2-羟基-3-氰基-4-三氟甲基吡啶。讨论了10%钯碳的用量，反应温度，以及碱等对反应的影响，化合物(3)还原的最佳的反应条件：10%钯碳量是化合物(3)质量的5%，最佳反应温度：35℃，产率：85.0%。 结论：成功合成了目标化合物2-氯-3-氨基-4-三氟甲基吡啶，通过优化反应条件，提高了反应收率。
目的：通过体外特异阻断试验,观察TGF-β1/Smads信号通路在环孢素A致肾小管上皮细胞转分化中的作用,探讨ILK是否作为TGF-β/Smads信号通路下游因子参与肾小管上皮细胞转分化。

方法：1.构建ILK siRNA。2.大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)分设正常组及CsA诱导组,后者分别采用CsA不同浓度和时间处理,观察细胞增殖抑制情况,选择CsA最佳时间和最适浓度。3.将NRK52E细胞培养分为5组：空白对照组(A组)：仅加入含10%胎牛血清的H-DMEM培养基；CsA处理组(B组)：细胞培养液加CsA(1mg/L);干预1组(C组)：加TGF-β1阻断剂(SB431542,10umol/L)预孵一小时后再加入CsA CDK 抑制剂 (1mg/L)；干预2组(D组)：转染有效ILKshRNA(KD-ILKshRNA,剂量MOI=20)72h后加入CsA (1mg/L);干预3组(E组)：转染无效ILKshRNA (NC-ILKshRNA,剂量MOI=20)72h后加入CsA (1mg/L)。上述各组分设3复孔,培养48h。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1以及Smad2、Smad7、 ILK、FSP-1mRNA的表达,蛋白印迹法(Western-blot)检测TGF-β1、Smad7、ILK、

FSP-1的蛋白表达。 结果：1.从慢病毒载体pGCSIL-hU6/GFP-ILK-2中扩增、重组、酶切后获得大约7800bp, DNA测序结果与Genbank中报道的ILK基因序列一致。2.重组质粒转染NRK-52E细胞后可观察GFP荧光表达,Western blot证实与GFP-ILK-2融合蛋白大小基本一致的阳性条带；病毒滴度为1×109pfu/ml; RT-PCR检测其对ILK基因表达的敲减效率>80%。3. TGF-β1mRNA及蛋白的表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞TGF-β1mRNA及蛋白表达量均显著增加(P<0.01),其中C组、D组表达量显著低于B组(P<0.01),C组的表达量又显著低于D组(P0.05)。4.

Smad2mRNA表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞Smad2mRNA表达量均显著增加(P<0.01),其中C组、D组、E组表达量显著低于B组(P<0.01),C组的表达量又显著低于D、E组(P<0.05),其中C、D、E组表达量均显著高于B组(P<0.01),D、E组表达量又显著低于C组(P<0.01),C、D组表达增加程度显著低于B组(P0.05),D组表达量显著低于C组(P<0.01)。7.FSP-1mRNA及蛋白的表达情况：与A组比较,CsA处理后的各组细胞FSP-1mRNA及蛋白表达量均显著增加(P<0.05),C组、D组表达增加程度均显著低于B组(P0.05),D组表达量显著高于C组(P
ZNF580是由本课题组克隆的一种新的人C2H2型锌指蛋白基因，与Krüppel样锌指转录因子（Krüppel-like 一般 以及 factors, Klfs）家族成员类似，具有参与血管的形成和细胞内信号的转导等功能。而eNOS（内皮型一氧化氮合酶）是维持内皮细胞正常功能所必需的，对于血管的舒张具有很重要的意义。本实验旨在探讨ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS中的作用机制。 目的： 以人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926）为体外模型，在转化生长因子TGF-β的作用下，研究人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580表达情况，分析ZNF580基因表达与内皮细胞稳态相关因子eNOS之间的关系，以及ZNF580基因过表达和低表达对eNOS表达的影响，进一步揭示ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS以及维持内皮细胞稳态中的作用。 方法： ①人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养至EA.hy926细胞生长成单层后备用。②利用Lenti-GFP-ZNF580和Lenti-RNAi-ZNF580瞬时转染EA.hy926内皮细胞，获得瞬时过表达和低表达ZNF580的EA.hy926细胞。运用倒置荧光显微镜观察转染效率，定量PCR以及western-blot鉴定转染后ZNF580和eNOS的表达情况。pGL3-control, pGL3-eNOS-Luc和β-gal质粒共转染EA.hy926细胞，单荧光素酶报告试验检测eNOS和ZNF580的变化趋势是否一致。③胰酶消化收集对数生长期EA.

2 TGF-β1诱导VSMC分化标志基因SM22α和SMα-actin表达 SM22α和SMα-actin表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志, PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要标志。采用Western blot方法,检查TGF-β1对各种标志基因表达的影响。结果显示,在TGF-β1处理的VSMC中,分化标志基因SM22α和SMα-actin表达明显升高,而增殖标志物PCNA表达显著降低,这些基因的表达变化依赖于TGF-β1作用的时间和浓度。其中,浓度为2 BMN 673化学结构 ng/ml和作用时间为48 h时变化最为显著。 1.3敲减TβRI表达对VSMC分化和去分化标志基因表达的影响 将靶向TβRI的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性TβRI表达后,研究TβRI在TGF-β1诱导VSMC分化中的作用。Western blot结果显示,转染TβRI-siRNA可使TβRI mRNA和蛋白表达水平降低约75~80%,表明该基因的表达被有效敲低。在TGF-β1刺激下,转染TβRI-siRNA的VSMC中SM22α和SMα-actin的表达明显降低,相反,增殖标志物PCNA的表达显著增加。 1.4 KLF4在TGF-β1诱导TβRI表达及VSMC分化中的作用 虽然已经发现KLF4是参与细胞生长、分化和凋亡的调控,但KLF4是否通过TβRI介导TGF-β1的作用目前尚不清楚。 RT-PCR和Western

blot结果表明,TGF-β1显著诱导KLF4和TβRI基因的转录和蛋白表达,并具有明显的时-效(6、12、24、48 h)关系。2 ng/ml TGF-β1作用于VSMC 6 h后,KLF4和TβRI的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,两者的表达变化呈正相关关系。 为了阐明KLF4与TβRI表达之间的关系,将KLF4-siRNA导入VSMC,阻断内源性KLF4表达后,明确KLF4在TGF-β1诱导TβRI及VSMC分化标志基因表达中的作用。RT-PCR和Western HKI 272 blot分析结果显示,转染KLF4-siRNA可敲减KLF4表达60%以上。在敲低KLF4表达的VSMC中,TGF-β1诱导TβRI表达的作用被取消,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也明显下降,表明KLF4介导TGF-β1对TβRI表达的诱导作用。 另外,将KLF4腺病毒表达载体Ad-KLF4感染VSMC,观察强制表达KLF4对TβRI和VSMC分化标志基因表达的影响。RT-PCR和Western blot分析证实,在KLF4过表达的VSMC中,TβRI表达明显高于空载体对照组,与此同时,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也显著升高。 2. TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号通路诱导KLF4磷酸化和KLF4与Smad2/3相互作用 TGF-β1通过与VSMC上的相应受体相互作用而触发细胞信号的跨膜转导,进而活化Smad信号通路而激活相关基因表达。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是胞内信号进行交互作用的重要信号转导通路。在上述阐明KLF4通过TβRI介导TGF-β诱导VSMC分化的基础上,本部分实验探讨TGF-β1对Smad和MAPK信号途径的影响,以期阐明TGF-β1诱导KLF4活化和促进细胞分化的信号转导机制。

2.1 TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4磷酸化 VSMC经TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min,用磷酸化丝氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后检测磷酸化KLF4的水平。结果显示,随着TGF-β1刺激时间的延长,磷酸化型KLF4水平逐渐升高,在TGF-β1刺激20~40 min内,其磷酸化水平增加2倍;同时,TGF-β1刺激后,磷酸化型Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)和p38 MAPK(p-p38)水平也显著升高。 分别以TβRI特异性抑制剂SB431542、p38特异性抑制剂SB203580和ERK特异性抑制剂PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 Autophagy inhibitor ng/ml的TGF-β1刺激细胞40 min。Western blot结果显示,SB431542或SB203580预处理细胞可显著抑制KLF4磷酸化,而PD98059对KLF4磷酸化无明显影响。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4磷酸化不再产生明显影响。证明TGF-β1诱导的KLF4磷酸化依赖于Smad和p38 MAPK信号途径的激活。 2.2 TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3相互作用 免疫共沉淀分析结果显示,VSMC被TGF-β1处理后,KLF4与Smad2/3相互作用形成的复合物明显增加。VSMC在TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min后,随着刺激时间的延长,KLF4与Smad2/3的结合明显增加,交互免疫沉淀也得到相似的结果。表明,TGF-β1能显著促进KLF4与Smad2/3的相互作用,并具有明显的时效关系。 为了检查KLF4磷酸化是否影响其与Smad2/3的相互作用,以SB431542、SB203580和PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 ng/ml TGF-β1刺激细胞40 min。免疫共沉淀分析结果显示,在SB431542和SB203580预孵育的VSMC中,KLF4与Smad2/3的相互作用明显降低,交互免疫沉淀得到相似的结果。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4与Smad2/3的相互作用不再产生明显影响。上述结果表明,TGF-β1通过Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4发生磷酸化修饰,而磷酸化型KLF4与Smad2/3的结合活性明显增加。 KLF4磷酸化位点定点突变实验证明,转染KLF4磷酸化位点(S470A)突变体的细胞再用TGF-β1处理时,KLF4的磷酸化水平明显降低,KLF4与Smad2/3的相互作用较对照组(转染野生型KLF4表达载体)降低。这些结果进一步提示,TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3之间的相互作用。 2.

3USP2b对TBK1的K63位点泛素化影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA,以及Myc-TBK1、HA-Ub,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Flag-USP2b和Myc-TBK1以及HA-Ub (K48)或者HA-Ub (K63),使用Myc标签抗体做IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Myc-TBK1, HA-Ub和Flag-USP2b或者USP2bC67A,使用Myc标签抗体做IP,

Western blot检测TBK1的泛素化水平。 3.4USP2b对TBK1激酶活性的影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b表达质粒或者USP2干扰RNA, SeV刺激6h,使用TBK1抗体做IP,检测TBK1激酶活性。 4. USP2b的抗病毒作用 HEK293细胞转染Contrl质粒、USP2b或者USP2b C67A,24h后进一步转染poly(I:C)或者PBS,8h后,VSV感染24后,收集培养细胞的上清(含VSV),剩余细胞提取RNA,上清做空斑试验,检测病毒滴度；RNA反转录成cDNA, selleck化学药品 real-time PCR检测细胞内VSV RNA复制。 HEK293或THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA,方法同上,分别检测病毒滴度以及VSV RNA复制。 5. USP2b在其他天然免疫信号通路中的作用 HEK293细胞转染USP2b质粒或者干扰RNA,同时转染TRIF, cGAS加STING和IFN-β-luc报告基因质粒,报告基因检测IFN-β-luc的活化。

THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA48h,分别用LPS、poly(I:C)刺激或者转染ISD12h, PCR检测IFN-β基因表达。 研究结果： 1.SeV感染HEK293或THP1细胞后,USP2表达下调 2. USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达。 2.1过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β-luc的活性 2.2过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β基因的表达 2.3过表达USP2b抑制SeV诱导的IRF3-luc的活性 2.4USP2b的点突变C67A不能抑制SeV诱导的IFN-β-luc以及IFN-β基因表达。 3.干扰掉USP2b后,增强IFN-β的表达 3.1USP2b的特异性siRNA可以干扰掉USP2b的表达(mRNA和蛋白水平)。 3.2干扰掉USP2b后,SeV诱导的IFN-β-luc活性以及IFN-β基因都增加。 4. USP2b靶向TBK1 USP2b抑制RLRs信号通路中的接头分子RIG-I,

MDA5, MAVS,TBK1活化的IFN-β-luc和IFN-β基因,而对IRF3-5D活化的IFN-β-luc和IFN-p基因表达没有影响。 FK228 5. USP2b能够对TBK1的K63位去泛素化 5.1USP2b与TBK1相互作用。 Dolutegravir小白鼠 5.2过表达USP2b降低TBK1泛素化水平,USP2b的点突变C67A则不能降低BK1泛素化。相反,干扰掉USP2b后,TBK1的泛素化水平增加。作为对照,USP2b对RIG-I和MAVS的泛素化水平没有影响。 5.3过表达USP2b能够减少TBKl的K63位泛素化水平。 6. USP2b消弱TBK1激酶活性 过表达USP2b消弱SeV诱导的TBK1激酶活性,相反,干扰掉USP2b后,SeV诱导的TBK1激酶活性增加。 7. USP2b负调细胞的抗病毒反应 过表达USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA复制增加,相反,干扰掉USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA受到抑制。 8. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导的I型干扰素信号通路 过表达USP2b抑制TRIF(TLR3通路)以及cGAS加STING (DN A通路)诱导的IFN-p-luc活性,相反,干扰掉USP2b后,IFN-β-luc活性增加。THP1细胞中,干扰掉USP2b后,LPS (TLR4配体)、poly(I:C)(TLR3配体)以及ISD (DNA受体活化剂)刺激的IFN-β基因表达增加。 结论： 1.SeV刺激后,USP2b表达下调,USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素通路。 2. USP2b靶向TBK1,通过与TBK1相互作用,对TBK1进行K63位去泛素化。 3. USP2b负向调控细胞的抗病毒反应。 4. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导其他天然免疫信号通路。 创新点和意义： 1.本研究首次证明USP2b可以负向调控IFN-β的产生及细胞的抗病毒反应。研究发现USP2b负向调控IFN-β的产生的机制是通过与关键激酶TBK1相互作用,进而去其进行K63位的去泛素化,从而抑制TBK1的活性。 2.由于TBK1作为病毒(包括RLRs,TLR3和DNA受体)诱导I型干扰素产生的关键激酶,USP2b可以广泛参与调控I型干扰素的表达及抗病毒反应。 3.

1%和62.2%。加入p38MAPK的抑制剂,即为SB203580后明显抑制了SDF-1α诱导的Rac-1和Rac-2蛋白表达。结论：(1)调控Rac表达的最佳SDF-1α浓度为200ng/ml,最佳时间点为12小时；(2)SDF-1α调控Rac的表达是CXCR4和p38MAPK依赖的。 结论 1. hEPCs在SDF-1α诱导下(分1h、2h、6h、12h、24h五个时间点)极性发生了变化,无论在细胞形态还是细胞受体的极化均发生改变,同时hEPCs的细胞群向SDF-1α方向发生了定向迁移。

2.在200ng/ml SDF-1α作用下,Rac蛋白在的亚型racl和rac2其mRNA和蛋白都是在12小时表达量最高。加入CXCR4的抑制剂AMD3100, Rac1和Rac2蛋白表达明显减少；加入p38MAPK的抑制剂SB203580后Rac-1和Rac-2的表达亦明显减少,说明SDF-1α上调Rac表达,是CXCR4和p38MAPK信号通路依赖的。 潜在价值和创新点 1.建立了体外培养hEPCs的细胞培养体系; 2.通过Zigmond chamber的观察证明,脐血来源的hEPCs向SDF-1α方向运动； 3.体外调控Rac表达的最佳SDF-1α浓度为200ng/ml,最佳时间点为12小时;4. SDF-1α上调Rac表达,是CXCR4和P38MAPK信号通路依赖的。
研究背景 颈椎板切除术已被广泛应用于治疗儿童脊髓损伤、脊髓肿瘤、先天性畸形以及脊髓空洞症等疾病的治疗。然而,椎板切除手术后可能会发生脊柱的后凸畸形并最终导致神经功能障碍,严重影响人类身体健康。因此,深入探讨椎板切术后颈椎后凸畸形的发病机制有着重要科学意义。 在正常情况下,脊柱矢状面的轴向垂线应当通过颈1(C1)和胸1(T1)中心,颈椎前凸使矢状面的轴向垂线在C2-C7的后方。颈椎生理前凸的维持主要依靠颈椎前方、后方骨和软组织结构的完整及力量的均衡。颈椎前方的骨性结构和椎间盘等组织主要承受压力,后方的关节突关节、韧带和肌肉等组织则主要抵抗颈部张力。先前研究表明：椎板切除术后颈椎后凸畸形的发生是由于颈椎后伸力矩的破坏所造成的。颈椎板切除术后颈椎后方的肌肉韧带结构复合体以及骨性结构的完整性遭到了破坏,使得术前后方韧带所承载的牵张力负荷(后伸力矩)丢失,从而引起前方椎体所承载的压力性负荷增加并最终导致畸的形发生。Pal和Sherk等人对颈椎生物力学研究发现64%的轴向性负荷经由两侧的关节突关节均匀承载,颈椎椎板切除术后这个轴向性负荷将向前转移,估计将增加前方椎体10倍于原来的压力性负荷。因青少年椎体生长板正处在生长发育期,椎板切除术后异常压力的增加使得生长板软骨细胞发育迟滞、凋亡加速,出现椎体楔形变从而形成后凸畸形。

FK228购买 Epigenetics合成 Library high throughput 软骨终板在维系脊柱的生物力学结构完整性以及椎间盘营养方面起重要作用。近年来,异常应力下生长板软骨细胞凋亡与颈椎后凸畸形的关系逐渐受到重视,对于生长板软骨细胞凋亡是否参与了椎板切除术后颈椎后凸畸形的发生过程目前尚未有研究报道。此外,异常应力通过何种信号通路诱导软骨细胞凋亡亦未被完全阐明。对于这些问题的回答,需要我们做出进一步的深入研究。

目的： 1.建立椎板切除术后青少年颈椎后凸畸形的动物模型,为研究后凸畸形提供有效的研究载体。 2.通过对体外培养的生长板软骨细胞凋亡机制的研究,以期从分子生物学角度解释椎板切除术后青少年颈椎后凸畸形的发病机制。 方法： 1.24只3月龄大山羊随机分成两组：椎板切除术组(n=12),和对照组(n=12)。分别于手术前、手术后当天以及手术后3、6个月在麻醉下拍摄标准颈椎侧位片,并采用后切线夹角法来评估颈椎曲度的变化。通过透射电镜法以及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术(TUNEL)来验证软骨终板的细胞凋亡。 2.取体重100-150g SD大鼠的颈椎体生长板软骨进行原代软骨细胞的分离及培养,通过软骨细胞形态以及二型胶原免疫荧光染色等方法鉴定软骨细胞。分别给予第二代软骨细胞施加0、0.1、0.2、0.5MPa持续静态压力,倒置相差显微镜观察软骨细胞形态变化,CCK-8法检测软骨细胞存活率,流式细胞仪以及TUNEL法检测软骨细胞凋亡率,Western blot法检测MAPK以及线粒体凋亡相关蛋白表达情况。 结果： 1.体内实验部分： (1)影像学结果： 术前两组山羊颈椎曲度之间无明显统计学差异,通过术后与术前X光片比较发现三个月后椎板切除手术组山羊开始发生后凸畸形,在第六个月时后凸畸形进一步加重,而对照组山羊颈椎曲度在整个实验时间内并未发生明显变化。术前手术组山羊C2-C5平均后切线夹角为-15.8±0.8。,术后三个月降低为19.1±1.1。而到第六个月的时候则为20.2±0.6。。手术后与手术前后切线夹角的变化揭示了后凸畸形的形成。 点击此处 (2)软骨细胞凋亡： 在整个观察时间点内对照组生长板仅有少量的凋亡细胞。然而,椎板切除手术组在手术后第三个月即可以观察到大量凋亡的软骨细胞(29.7±3.4%),并且凋亡软骨细胞比例在第六个月时进一步增加(35.6±5.4%),手术组软骨细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义。 (3)透射电镜观察： 对照组生长板软骨细胞呈不规则形或椭圆形,细胞膜完整,细胞器丰富,染色质均匀分布。椎板切除术组可见典型的凋亡的软骨细胞,表现为细胞膜皱缩,细胞核碎裂,染色质浓缩以及细胞器的减少。 2.体外实验部分： 1.持续静态压力对终板软骨细胞活力影响： 为研究持续静态压力对生长板软骨细胞存活率的影响,我们分别给予软骨细胞施加不同静态压力(0,0.1,0.2和0.5MPa)加压1,6,12,24,36,和48小时后采用CCK-8法检测细胞存活率。结果显示软骨细胞存活率呈压力以及时间依赖性降低,其中在0.5Mpa大气压下作用24小时细胞存活率约为50%。 2.持续静态压力可以诱导生长板软骨细胞凋亡： 经0.5Mpa大气压加压24小时后,加压组软骨细胞TUNEL的阳性率明显高于对照组,差异具有统计学意义(48.77±4.14%vs.4.43±0.

CABE和WP1066抑制ARP-1和U266细胞IFNα诱导的STAT3磷酸化,对ARP-1的抑制作用优于U266。 11. JAK/STAT3抑制剂WP1066下调缺氧诱导的可溶性蛋白裂解液HIF-1α和HIF-1β表达,而这些蛋白在蛋白裂解液高速离心后留下的不可溶沉淀有升高趋势。我们的MSD研究显示骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞在正常氧浓度下仅有低表达HIF-1α,而HIF-1β持续表达。我们放置细胞在缺氧培养箱(氧浓度l%,二氧化碳浓度5%)4、8、16和24小时后MSD检测HIF-1α表达,我们发现HIF-1α表达在8小时表达最高,而后逐渐下降。因此我们使用WP1066浓度2.5、5和10μM在缺氧培养箱作用8小时检测HIF-1α和HIF-1β,我们发现WP1066下调缺氧诱导的可溶性蛋白裂解液HIF-1α和HIF-1β表达,而这些蛋白在蛋白裂解液高速离心后留下的不可溶沉淀有升高趋势。

12. JAK/STAT3抑制剂WP1066下调可溶性蛋白裂解液STAT3和STATS表达,STAT3和STAT5表达在蛋白裂解液高速离心后留下的不可溶沉淀中升高。我们使用WP1066浓度2.5、5和10μM作用MM细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞24小时,IL-6作用30分钟,分别检测可溶性蛋白裂解液和不可溶沉淀中pSTAT3和STAT3表达,我们发现WP1066抑制pSTAT3表达,可溶性裂解液和不可溶沉淀获得一致结果,而WP1066抑制可溶性蛋白裂解液STAT3表达,而同时STAT3在不可溶沉淀中表达增高。因此我们继续检测了时间梯度,我们选择WP1066浓度5μM作用ARP-1和U266细胞4、8、12和24小时,检测STAT3、STATS和JAK2表达,结果发现在药物作用12小时后STAT3和STAT5下调,而JAK2下调略弱于STAT3和STAT5。

所以 小结 1.骨髓瘤细胞表达TLRs mRNA, MM.1S、MM.1R和ARP-1细胞明显表达TLR4,而U266细胞表达不明显。TLR4表达在细胞表面,而且在原代骨髓瘤细胞表达。 2.LPS促使TLR4阳性表达的MM细胞株细胞出现明显增殖,保护阿霉素诱导的凋亡,诱导细胞G0/G1期细胞明显减少,S期细胞明显增多。 http://www.selleck.cn/products/pci-32765.html 3.LPS促进细胞增殖和IL-18作用依赖MAPK信号通路。LPS明显增加B7-H1和B7-H2的表达,少量增加CD40表达,TLR4活化的骨髓瘤细胞抑制健康供者外周血T细胞增殖。 4.无论在血清饥饿或血清培养状态,细胞因子IL-6、IFNα和IFNβ都能刺激STAT3和STAT3磷酸化。 5. JAK/STAT3抑制剂WP1066对骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266和原代CD138+细胞均有增殖抑制作用。WP1066诱导细胞凋亡呈浓度依赖,而且在细胞凋亡过程中,凋亡相关基因caspase3和PARP发生裂解。 6. JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WP1066抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,呈浓度和时间依赖JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WP1066抑制IFNα诱导的STAT3磷酸化。 7. JAK/STAT3抑制剂WP1066下调缺氧诱导的可溶性蛋白裂解液HIF-1αHIF-1β和STAT3、STAT5表达,而在不可溶沉淀有升高趋势。
研究背景

Ruxolitinib核磁共振 乳腺癌是女性患病和死亡人数最高的恶性肿瘤,远处转移是乳腺癌致死的主要原因。包括乳腺癌在内的许多恶性肿瘤的转移并非随机迁徙,而是有固有路径和特定的转移器官。骨骼是乳腺癌细胞容易转移的部位,远超过肝、肺等部位转移,但是乳腺癌嗜骨转移的机理迄今为止尚待进一步阐明。 核因子κB受体活化因子(RANK)和其配体即RANKL对骨骼改建、免疫系统成熟有重要作用。骨保护素(OPG)作为游离的诱饵受体,能够和RANK竞争性结合RANKL。陆续有研究发现RANK或RANKL在原发性骨肿瘤和易发生骨转移肿瘤的细胞上表达,于是人们开始关注RANKL和RANK相互作用对肿瘤细胞生物学功能以及肿瘤嗜骨性转移的影响和作用。先前研究显示RANKL能够诱导部分RANK阳性的肿瘤细胞发生趋化迁移。我们假设骨骼中成骨细胞等细胞通过RANKL/RANK途径诱导循环系统中的肿瘤细胞迁移至骨,最终形成骨转移。目前关于RANKL对RANK阳性乳腺癌细胞诱导迁移的机制尚未完全阐明;此外,乳腺癌细胞中RANKL/RANK表达的调控因素仍鲜有报道。因此,本课题以人乳腺癌细胞为研究对象,在证实RANKL/RANK途径促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的基础上,明确参与RANKL诱导乳腺癌细胞迁移的下游信号分子,并研究了缺氧微环境对乳腺癌细胞RANKL/RANK途径的调节及其可能的机制。 研究方法 第一部分RANKL/RANK途径对人乳腺癌细胞迁移能力的影响 首先通过体外细胞划痕实验和Transwell趋化小室实验,证实RANKL对MDA-MB-231细胞趋化迁移能力的影响。同时用OPG预处理RANKL后,观察对RANKL诱导的细胞迁移的影响。其次,将能够表达、分泌RANKL的人成骨细胞hFOB1.

5 mmol/L)和对照组(不含2APB),在糖氧剥夺情况下培养2 h,然后恢复正常全培养基复氧培养48 h。用Western blot检测星形胶质细胞神经生长因子的表达水平;用ELISA检测星形胶质细胞条件培养液中神经生长因子的含量。结果表明,0.5 mmol/L 2APB可以诱导正常情况下及糖氧剥夺再灌注情况下体外培养星形胶质细胞NGF的合成和释放(P<0.01)。此外,JNK阻滞剂可抑制糖氧剥夺再灌注情况下2APB诱导的星形胶质细胞神经生长因子的释放。综上,TRPV2激活可以影响糖氧剥夺再灌注情况下体外培养星形胶质细胞神经生长因子的合成和释放。TRPV2有可能成为脑缺血再灌注后的潜在治疗靶点。
云芝多糖简称PSK,是从担子菌亚门杂色云芝菌中提出的多糖,具有丰富的生物学功能,广泛应用于临床肿瘤治疗。本文就目前国内外对云芝多糖的抗肿瘤机制研究及临床应用研究进展做一综述。1对肿瘤免疫的影响1.1对DC细胞的影响DC细胞是人体最大的抗原呈递细胞,研究发现,在癌症患者体内,DC细胞的生物学功能表达降低。PSK可以促进DC细胞成熟,使其高表达MHCII、CD40、CD80、CD86、CD83及肿瘤坏死因子等[1]。PSK还可通过DC细胞刺激活化的毒性T细胞产生TNF-β及IL-
Objective:The

SB203580 anti-inflammatory effects of Ecklonia cava(EC)and its mechanism of action were examined in phorbol-12 myristate 13-acetate(30 nmol/L)and A23187(1μmol/L)(PMACI)stimulated human mast cell line-1 cells.Methods:Nitric oxide content,inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 protein expression,pro-inflammatory

cytokines including IL-1β,TNF-α,and IL-6 mRNA and protein expressions were determined.In addition,extracellular regulated protein kinases/mitogen-activated Alectinib 而且 protein kinase(ERK/MAPK)activation was examined.Results:EC dose-dependently suppressed inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 protein expression and subsequently it reduces nitric oxide content

in PMACI stimulated human mast cell line-1 cells.EC dose-dependently inhibited the mRNA as well as protein expression of TNF-α,IL—1β,and TL-6 in the PMACI stimulated human mast cell line-1 cells without any cytotoxic effect.Furthermore,EC significantly inhibited PMACI induced phosphorylation of ERK1/2 in a dose-dependent manner without affecting the total protein levels.Conclusions:EC exert its anti-inflammatory actions via inhibition of ERK/MAPK signalling pathway,suggesting that EC is a potent and efficacious anti-inflammatory agent for mast cellmediated inflammatory diseases.
目的:探讨养阴清肺方对钴60照射后肺成纤维细胞的生长周期及凋亡的影响。方法:制备实验用含药血清:空白组、中药组、激素组、中药加激素组;采用钴60射线照射肺成纤维细胞后,用不同含药血清培养细胞,分别于24、48、72 h后用流式细胞技术检测各组的细胞周期及细胞凋亡。结果:24 h,各药物组的细胞凋亡与空白组均有差异(P0.05)。72 h,各药物组细胞凋亡与空白组均有差异(P<0.

Recent epidemiologic studies and clinical trials have shown consistently that Asian ethnicity is a favorable prognostic factor for overall survival in non-small cell lung cancer(NSCLC),independent of smoking status.Compared with Caucasian patients with NSCLC,East Asian patients have a much higher prevalence of epidermal growth factor receptor(EGFR) mutation(approximately

30% vs.7%,predominantly among patients with adenocarcinoma and never-smokers),a lower prevalence of K-Ras mutation(less than 10% vs.18%,predominantly among patients with adenocarcinoma and smokers),and higher proportion 不 of patients who are responsive to EGFR tyrosine kinase inhibitors.The ethnic differences in epidemiology and clinical behaviors should be taken into account when conducting global clinical trials that include different ethnic populations.
3年前棘皮动物微管相关类蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma 时间 kinase,ALK)融合基因被发现存在于部分非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中。该融合基因常见于不吸烟的肺腺癌患者,有其独特的病理学特征,可以诱导肿瘤生成。ALK抑制剂能够作用于该基因的下游信号传导通路并拮抗其促肿瘤生成活性。本文旨在介绍EML4-ALK基因的结构、功能、生物学特征、检测方法及其在肺癌诊断治疗中的意义。
本月全球药品研发进展取得成效的药物有40个,比上月增加8个,除进入Ⅲ期临床研究阶段的药品数量较上月减少2个外,进入注册和注册前研究阶段的药品数量均有不同程度的增加。
2010年全球生物制药行业研发总费用达674.1亿美元,其中研发投入前10名的制药公司占总投入10%以上。近年来新药研发投入居高不下主要受专利期满、行业并购等因素影响。
对非小细胞肺癌患者生存状况产生影响的因素很多,如体力状况(PS)、性别、年龄、分期、是否吸烟、种族,以及某些分子生物学特征等。一些与治疗无关的因素称为预后性因素;另外一些因素可用于预测治疗结果,称为预测性因素,如切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、表皮生长因子受体(EG-FR)突变、性别及组织学类型,其中组织学类型对治疗结果
2011年伊始,国际肺癌领域的一个大动作,是国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会联手在《Journal

of Thoracic Oncology》上公布了关于肺腺癌的国际多学科分类新标准。由于肺癌的异质性,同一治疗手段对肺癌的治疗效果往往是南辕北辙,由此,肺癌领域的临床研究和临床处理,重要的一环是对肺癌的分类和分期以尽量减少其异质性,从而达到治疗的归一性。从肺癌的分类历史看,分类逐渐从粗放型向精致型演进。先是上个世纪小细胞肺癌和非小细胞肺癌的简单分类,而后是早期、局部晚期和晚期的分类,接着是病理学家对各种亚型的进一步形态学分类。总体而言,这些分类基本是单学科的自娱自乐,并没有多学科的融会和贯通,特别是非小细胞肺癌的病理学分类几乎对治疗和预后没有重大的指导作用,以至于在相当长的一段时间内,临床医生只要依据非小细胞肺癌这一粗放的分类就可以进行无差别的治疗了,这也是半个世纪来肺癌治疗裹足不前的重要原因之一。进入了21世纪,新的诊断技术新的治疗药物特别是对肺腺癌分子生物学的深入了解,诞生了新的治疗模式,对肺癌的分类需求就显得特别迫切了。于是就有了这一由国际著名学会联手精心而作的肺腺癌新分类。作为这一新分类的审稿人之一,早在2008年我便接触到这一新分类的内容了,对其修订过程了解颇多,也见证了国际许多学者对这新分类的贡献,也可以说这是国际肺癌学界智慧的结晶。这样,在肺腺癌新分类发表之际,我便组织了广东省人民医院、广东省肺癌研究所的专家进行翻译和解读。实际上,一个新分类的生命力,更在于在实践中的应用和拓展,希望我们的解读,只是作为敲门砖,大家可以在更大的范围内自由翱翔,这样的解读也就达到目的了。
美国临床肿瘤学会(ASCO)近年会议发布了大量的阳性和阴性结果,一线治疗的非选择时代已经过去,维持治疗也应该加以选择,二线化疗、靶向治疗各有优势,辅助治疗仍为主导。同时应该重视生物标志物的重要性,生物标志物指导的靶向个体化治疗将大大改善晚期NSCLC患者的预后。
新药研究与开发FDA批准艾替班特用于治疗遗传性血管性水肿急性发作Shire药业宣布FDA已批准其艾替班特(icatibant,Firazyr)注射液上市,用于治疗18岁以上成人遗传性血管性水肿(HAE)急性发作。艾替班特治疗HAE急性发作的疗效和安全性已在双盲、随机、对照的FAST

selleck激酶抑制剂 1、2和3的3次临床试验中评估,总共入选223名患者,平均年龄38岁,64%为女性,95%为白种人。近57%的患者
The advent of targeted therapies, combined with an unsustainable rate of failure in oncology drug development, has resulted in a number of new approaches to clinical trials.

pylori)为寄生在胃黏膜的革兰氏阴性螺旋杆菌,全球大约有一半以上的人胃内有H.pylori感染,其中老年人群感染率尤高。大量临床研究表明,H.pylori慢性感染不仅直接导致慢性胃炎、胃溃疡并促进胃癌发生,也可引起或促进消化系统外疾病,如格林巴利综合症(脊神经和周围神经的脱髓鞘疾病)、高血压、缺血性心脏病、脑缺血和中风,而这些疾患均为AD发生的危险因子。最近的一些临床流行病学调查研究为H.pylori感染与AD相关提供了更为直接的临床证据。但是H.pylori感染到底通过何种途径促进AD的发生,其机制尚无报道。

本研究中重点探讨了H.pylori感染对tau蛋白磷酸化、Aβ40、Aβ42生成以及大鼠空间学习记忆的影响及其机制。主要结果如下： 第一部分幽门螺旋杆菌通过激活GSK-3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化 因为 微管相关蛋白tau的过度磷酸化参与包括阿尔茨海默病在内的许多神经退行性疾病的发生。有报道认为幽门螺旋杆菌感染是AD发病的危险因素,但尚无直接的实验证据。 [目的]阐明H.pylori感染对tau蛋白磷酸化的影响及其机制。 [材料和方法]实验在整体和细胞水平进行。整体水平采用雄性SD大鼠,腹腔注射H.pylori滤液,280μl/只/天,给滤液浓度研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基(体积比1：1)对照组、中浓度和高浓度H.pylori滤液注射组、对应浓度大肠杆菌(Escherichia coli. E.coli)滤液注射对照组,依据浓度实验结果确定给滤液时间点研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基注射14天对照组、中浓度H.pylori滤液注射7天组、14天组和21天组,注射完毕后,麻醉取脑分离海马,用免疫印迹检测tau蛋白AD相关位点磷酸化水平,用免疫组化检测tau蛋白在神经元内的定位及小胶质细胞活化情况,用酶联免疫吸附检测炎症介质IL-8和TNF-a的含量。细胞水平采用小鼠成神经瘤(N2a)细胞系,给滤液浓度研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基作为对照,低、中、高浓度H.pylori滤液孵育24小时组,对应浓度E.coli滤液孵育24小时组。依据浓度实验结果给滤液时间点研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基对照组,中浓度H.pylori滤液孵育6、24和36小时组。免疫印迹检测tau磷酸化水平,tau相关蛋白激酶／磷酸酯酶活性；给予GSK-3抑制剂氯化锂和SB216763预处理N2a细胞30分钟,再用H.pylori滤液孵育24小时,免疫印迹检测tau磷酸化水平。

selleck激酶抑制剂 [结果]H.pylori滤液大鼠腹腔注射或孵育小鼠成神经瘤细胞均导致AD相关tau蛋白磷酸化位点如Thr205、Thr231和Ser404明显过度磷酸化,并伴有糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的激活。给予GSK-3抑制剂能有效逆转H.pylori滤液导致的tau蛋白过度磷酸化。相同处理不影响使tau蛋白去磷酸化的关键蛋白磷酸酯酶-2A(protein 或者 phosphatase-2A, PP2A)的活性。另一种常见的肠道细菌E.coli同样处理不影响tau磷酸化水平。

[结论]H.pylori滤液在体内外可通过激活GSK3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化,促进AD样病变的形成。本实验结果为H.pylori感染在AD样tau病变中的作用提供了直接实验证据。 第二部分幽门螺旋杆菌通过增加早老素2的表达使β-淀粉样肽含量升高,损伤大鼠空间学习记忆 H.pylori感染是AD的高危因素,我们已经在第一部分阐明H.pylori滤液腹腔注射可通过激活GSK-3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化,那么H.pylori外周感染对AD的其他病变如认知功能和p淀粉样肽生成是否有影响?其机制如何尚无报道。 [目的]阐明H.pylori对SD大鼠认知功能和p淀粉样肽生成的影响及其机制。 [材料和方法]实验在整体和细胞水平进行。整体水平采用3月龄SD雄性大鼠,Morris水迷宫训练7天至15秒内能找到隐匿平台,形成空间记忆。然后随机分为对照组,H.pylori组和E.coli组,分别腹腔注射体积比为1：1的DMEM/Opti-MEM混合培养基,H.pylori滤液和E.coli滤液,280μl/只/天连续注射7天。注射第4天时水迷宫检测大鼠空间记忆保留情况。然后更换平台到新的象限水迷宫重新学习3天,训练结束24小时后检测大鼠对第二次学习的记忆力。第9天,水迷宫可视平台进行运动能力检测后处死动物,高尔基染色观察海马DG区树突棘密度和形态,尼氏染色观察海马和皮质区神经元数量和密度。麻醉取脑分离海马和皮质组织匀浆,并提取海马膜蛋白,用免疫印迹检测学习记忆相关突触受体蛋白在全海马匀浆及海马神经细胞膜的表达量及海马和皮质p-分泌酶(BACE-1),γ-分泌酶主要成分(早老素-1,PS-1和早老素-2,PS-2)的表达量。酶联免疫吸附分别检测海马和皮质Aβ含量。细胞水平用H.pylori或E.coli滤液孵育过表达了APP的小鼠成神经瘤细胞(N2a-APP)24小时然后检测Ap含量及p和γ-分泌酶表达量。 [结果]H.pylori滤液腹腔注射导致SD大鼠空间学习和记忆损伤并伴有海马DG区树突棘成熟障碍,同时海马和皮质的Aβ42含量明显升高且PS-2表达增加。在细胞水平用H.pylori滤液孵育N2a-APP细胞,检测发现H.pylori滤液孵育后细胞内、外Aβ42水平均升高,同时伴有PS-2上调。用E.

7细胞中P38MAPK表达的影响,从中探讨当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物抗动脉粥样硬化作用的信号转导调控机制。 实验方法: 1.制备当归补血汤煎液及当归黄芪提取部位,并将提取部位相互配比排列组合分组后制备成含药血清。 2.制备氧化低密度脂蛋白。 3.细胞常规培养;台盼蓝染色法检测细胞活力;用MTT法测细胞生长曲线及检测不同浓度对照血清、含药血清对RAW264.7细胞的存活率的影响。 4.免疫印记法检测当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物对氧化低密度脂蛋白激活RAW264.7细胞中P38MAPK表达的影响。 http://www.selleck.cn/p38-MAPK.html 实验结果: 1.运用血清药理学方法将当归补血汤煎液及当归黄芪提取部位组合物制备成含药血清。 2.将冻存的细胞株复苏后,细胞常规培养。台盼蓝染色法检测细胞活力＞95%,可用于实验。用MTT法测细胞生长曲线,选取传代后细胞培养至第四天待细胞生长稳定进行后续实验,每组均选取同样生长条件的细胞从而减少细胞本身的组间差异。兔血清本身对于细胞细胞有一定的营养作用能促进细胞生长,实验中应该尽量减少血清本身对细胞的影响,高浓度的兔血清对细胞生长不利,故选取10%兔血清浓度进行后续实验。

3.免疫印记检测结果显示: P38MAPK蛋白免疫印记检测结果显示:Ox-LDL组蛋白条带光密度比值为5.3167±0.16169,与空白对照组比较差异有意义(P＜0.05),说明Ox-LDL刺激RAW264.7细胞能够明显激活P38MAPK信号转导通路,增强P38MAPK的蛋白活性;抑制剂组与空白对照组比较差异有意义,说明抑制剂SB203580对P38MAPK蛋白活性有抑制作用。当归补血汤和当归黄芪提取部位组合物A组、B组与空白对照组比较差异有意义,说明当归补血汤和当归黄芪提取部位组合物有抑制P38MAPK蛋白活性作用:与Ox-LDL组比较有差异,说明当归补血汤与当归黄芪提取部位组合物A组、B组能下调P38MAPK蛋白活性;与抑制剂比较有差异,说明抑制剂较当归补血汤与当归黄芪提取部位组合物组下调P38MAPK蛋白活性作用强。当归补血汤与当归黄芪提取部位组合物A组、B组比较无统计学意义(P＞0.05),说明当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物在P38MAPK蛋白的表达中无差异。 不 磷酸化P38MAPK蛋白免疫印记检测结果显示:Ox-LDL组蛋白条带光密度比值为5.3767±0.36638,与空白对照组比较差异有显著性意义,说明Ox-LDL刺激RAW264.7细胞能够明显激活P38MAPK信号转导通路,增强磷酸化P38MAPK的蛋白活性;抑制剂SB203580组(1.7233±0.11015)与空白对照组比较差异显著,说明SB203580对磷酸化P38MAPK的蛋白活性有明显的抑制作用。当归补血汤和当归黄芪提取部位组合物A组、B组与空白对照组比较差异有意义,说明当归补血汤和当归黄芪提取部位组合物有抑制磷酸化P38MAPK蛋白活性作用;当归补血汤组(2.8567±0.34559)和当归黄芪提取部位组合物A组、B组与Ox-LDL组比较有差异(P＜0.05),说明当归补血汤与当归黄芪提取部位组合物能下调磷酸化P38MAPK蛋白活性:与抑制剂比较有差异,说明抑制剂较当归补血汤与当归黄芪提取部位组合物组下调磷酸化P38MAPK蛋白活性作用强。当归补血汤组与当归黄芪提取部位组合物A组、B组比较有差异(P＜0.05),说明当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物各组均能下调磷酸化P38MAPK的蛋白活性,当归补血汤的作用较当归黄芪提取部位组合物A组、B组明显。当归黄芪提取部位组合物A组与B组之间比较差异无意义(P＞0.05),说明当归黄芪提取部位组合物下调磷酸化P38MAPK的蛋白活性无差别。

实验结论: 100μg/ml的Ox-LDL刺激RAW264.7细胞15min后,可明显激活RAW264.7细胞内的P38MAPK信号转导通路,增强P38MAPK总蛋白和磷酸化P38MAPK的蛋白活性;P38MAPK抑制剂SB203580对P38MAPK的活化有明显的抑制作用;当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物能够抑制P38MAPK蛋白的表达,对磷酸化P38MAPK的活化有一定程度的抑制作用;其中当归补血汤的抑制作用较当归黄芪提取部位组合物明显。本实验证实了当归补血汤可以通过下调P38MAPK的活性从而阻断该通路的级联作用来减轻动脉粥样硬化炎症反应。所以,当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物可能通过下调P38MAPK信号转导通路以调控相关致炎因子的表达进而影响动脉粥样硬化的发生发展,阻断P38MAPK信号转导通路可能是当归补血汤及当归黄芪提取部位组合物抗动脉粥样硬化损伤的机制之一。
目的:探讨P38

Pifithrinα MAPK在顺铂化疗和热疗诱导肝癌细胞凋亡的机制,以及对正常肝细胞的影响,为临床应用提供实验依据。 方法:通过体外培养正常肝细胞HL-7702、癌旁肝硬化肝细胞QSG-7701和肝癌细胞QGY-7703,应用免疫组织细胞化学、MTT、激光扫描共聚焦显微镜、Western Blot、流式细胞仪和TUNEL法等方法观察顺铂和热诱导对其凋亡的影响,然后加入P38 MAPK的特异性抑制剂SB203580,再观察顺铂和热诱导对细胞凋亡情况的变化。 结果:P38 MAPK表达从正常肝细胞、癌旁肝硬化肝细胞到肝癌细胞逐渐增高。P38 MAPK的特异性抑制剂SB203580可以使细胞的凋亡率降低。3株培养细胞加顺铂后凋亡率均明显增加,存活率明显下降,加用P38 MAPK的特异性抑制剂SB203580后,可使细胞凋亡率下降。3株培养细胞对于顺铂的反应性不同,肝癌细胞最敏感,凋亡率和坏死率最高。热诱导可以使3株培养细胞发生凋亡,其中肝癌细胞最敏感,引起凋亡和坏死的细胞最多。 结论1顺铂诱导细胞凋亡有P38 MAPK通路的参与。 2热诱导可以引起细胞凋亡,这过程中有P38 MAPK通路的参与。 3癌旁肝硬化肝细胞的生物学特性与正常肝细胞和肝癌细胞都不同,属于正处在转化过程中的癌前期细胞,值得进一步研究。
目的探讨甲羟戊酸(Mev)对人系膜细胞(HMC)增殖及丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的影响及其机制。 方法本研究采用常规体外培养HMC:①随机分为两组,对照组,Mev组。Mev组设1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/L 7个浓度段。对促增生最明显的Mev组,分别于12、24、48h检测Mev对HMC的增殖程度。通过MTT法测定Mev对10%胎牛血清刺激的HMC增殖的影响。②随机分为四组,对照组、Mev组、Mev+SB203580组和SB203580组。以酶联免疫吸附法(ELISA)检测Mev刺激后MAPK通路下游TGF-β的表达。以Westernblot法检测Bax和Bcl-2及p38的表达。 结果①Mev对HMC增殖有促进作用,且作用呈一定的浓度依赖性和时间依赖性。②Mev组与对照组相比,TGF-β的表达增高(P＜0.