2.酶切富集AS-PCR方法的建立。设计一对野生型和突变型abl基因序列的通用引物，分别以野生型和突变型重组质粒作为模板，经PCR扩增出目的片段，将扩增出的片段进行酶切。另设计一对仅针对T315I突变的特异性引物，以酶切产物为模板，进行AS-PCR检测，对反应体系及反应条件进行优化。分析该方法的灵敏度及特异性。 结果： 1.通过体外定点突变PCR法成功构建了野生型pSG5M-Icotinibflag-abl(wild)和突变型pSG5M-flag-abl(T315I)的重组质粒标准品，且经酶切及测序鉴定与预期结果一致。 2.成功运用了酶切富集AS-PCR法检测bcr/abl基因T315I点突变，该方法的灵敏度为0.18%，实验至此并未出现假阳性，该方法特异性好。 结论： 1.成功构建了野生型pSG5M-flag-abl(wild)和突变BIBF 1120小鼠型pSG5M-flag-abl(T315I)重组质粒。 2.建立了检测abl基因T315I突变的酶切富集AS-PCR方法，为临床检测该基因突变提供了一种灵敏度高、特异性好的方法。
研究背景： 肿瘤细胞放化疗抵抗常可导致肿瘤预后不良。Aurora-A激酶(Aurora-A)是一种丝／苏氨酸蛋白激酶,与有丝分裂的纺锤体分离,中心体复制相关,且在多种肿瘤EPZ-6438订单中均高表达,是一种重要的癌基因。近期研究表明Aurora-A可促进肿瘤放化疗抵抗,由于Aurora-A与p53, BRCA1, BRCA2等多种DNA损伤应答蛋白有着相互作用,因此我们推测Aurora-A很可能通过调节DNA损伤应答促进肿瘤放化疗抵抗。 研究目的： 研究Aurora-A与DNA损伤应答的关系,揭示Aurora-A促进肿瘤放化疗抵抗的机理,探寻Aurora-A相关肿瘤的新型靶向药物分子,以期达到肿瘤治疗的最佳效果。

因此从这个意义上说,IM仍无法治愈CML。目前已有伊马替尼联合异基因造血干细胞移植治疗慢性髓性白血病治疗的相关报到,两者联合治疗可提高患者血液学及细胞遗传学缓解率。关于两种治疗方式对患者疗效及生存影响,目前国外虽有报道伊马替尼治疗慢性髓性白血病疗效优于异基因造血干细胞移Selleck植的治疗。但我国大样本相关研究报道不多,因此,本课题第一部分通过收集本中心近10年慢性髓性白血病患者服用伊马替尼或接受异基因造血干细胞移植治疗的相关情况,进一步分析两者疗效及生存,希望对临床治疗慢性髓性白血病治疗方式的选择提供依据,以最优化的方http://www.selleckchem.cn/products/jq1.html式提高患者长期生存率,使患者最大获益。 目前认为,CML患者伊马替尼治疗过程中仍有10%-25%患者产生耐药,其中ABL激酶区点突变是产生耐药主要机制之一。50%-90%伊马替尼耐药患者是由于ABL激酶区突变导致,点突变主要发生于P环、A环及比寻找更多邻区。已有报道ABL激酶区突变位点广泛、性质多样,部分是多位点突变同时存在,对伊马替尼耐药程度也不同,不同突变类型对患者疗效及生存影响也不同,因此对ABL激酶区进行突变检测变得越来越重要,本课题第二部分通过对CML患者骨髓或外周血采用巢式PCR扩增ABL基因激酶区的基因片段检测突变,来探讨此区域突变与IM耐药的关系及临床意义。

另外,超顺磁氧化铁作为最有希望的纳米颗粒被广泛研究,这主要源于其超顺磁性使纳米颗粒在外加磁场下定向移动,从而使纳米颗粒聚集于靶区并且能被核磁共振显像,达到药物靶向、示踪及监测目的。然而,单纯氧化铁纳米颗粒在水中很不稳定,一些疏水材料如油酸、聚乙二醇、普朗克尼、PLGA等可以包被氧化铁颗粒,使Metformin半抑制浓度其生物相容性明显增加。研究者们在不断增加磁性纳米颗粒的生物相容性的同时,也在不断探索药物智能释放的方法。已有研究报道,一些纳米材料可以在外界环境如氧化还原剂、温度、PH等刺激下降解实现药物的智能释放。然而,这些研究多数停留在化学反应的水平,少数涉及细胞水平,动物水平点击此处的相关研究更是鲜有。 为实现阿霉素靶向给药,我们采用阿霉素/聚酰胺@超顺磁氧化铁纳米颗粒(doxorubicine/rPAA@superparamagnetic iron oxide nanoparticles, DOX/rPAA@SPION),在动物水平,对其治疗selleck产品乳腺癌的疗效、毒副反应、生物分布及MRI显像进行研究。DOX/rPAA@SPION主要有3部分组成：阿霉素(DOX),以rPAA为骨架的高分子聚合物(reducible polyamidoamine graft poly(ethylene glycol)/dodecyl amine copolymers,rPAA),超顺磁氧化铁(SPION)。

免疫共沉淀结果表明在细胞膜去极化时PKCβ和PI4Kβ结合明显增多；(6) PKCβ特异性抑制剂Enzastaurin (LY317615)能够抑制去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用，RNAi实验抑制PKCβ的表达也能阻断细胞膜去极化增大电流的作用Selleck I-BET-762；(7)免疫共沉淀结果表明PI4Kβ和PKCβ或PKCα相互作用也存在于大鼠DRG神经元和心室肌细胞中。 结论：在爪蟾卵母细胞，细胞膜去极化通过激活PKCβ，进而增强PI4Kβ的活性，最终导致PIP_2合成增加。这一过程不依还有赖于细胞内外Ca~（2+）的存在。本研究揭示了膜电位通过细胞信号通路影响膜磷脂代谢的新机制。 第二部分GPCRs在细胞膜电位调节PIP_2代谢过程中的作用 目的：研究卵母细胞中G蛋白偶联受体类在细胞膜电位调节磷脂酰肌醇代谢过selleck程中的作用。 方法：应用显微注射的实验方法将药物注射进卵母细胞；使用双电极电压钳技术记录表达于卵母细胞的KCNQ2/Q3电流，并观察实验条件下电流的变化情况；通过显微注射将针对Gα不同亚型的反义核苷酸注射入卵母细胞，抑制Gα蛋白的表达；免疫共沉淀技术检测不同实验条件下卵母细胞中Gα和Gβ蛋白偶联情况。

结果显示BRAFV600E突变体在PCCL3/BRAF细胞和PCCL3细胞表达时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因mRNA表达水平在48h降低了50%到60%。细胞总体组蛋白乙酰化水平略有增加。染色质蛋白免疫共沉淀CHIP结果显示大鼠钠碘同向转运体NIS启动子区域：PCCL3/BRAF细胞诱导表达BRAFV600E突变时，组蛋白Hselleck激酶抑制剂3K9/14乙酰化位点在P1，P2和P3区域乙酰化水平降低，然而PCCL3细胞瞬时转染BRAFV600E突变时外显子EXON和P1区域H3K9/14乙酰化水平降低。在PCCL3/BRAF细胞中SAHA可以提高大鼠NIS启动子P1, P3，P4和NUE区域H3K9/14乙酰化水平。在PCCL3/BRAF很少和PCCL3细胞中，BRAFV600E突变仅影响H3K18和总H4大鼠NIS启动子P1和P2区域乙酰化水平。DOX1ug/ml诱导BRAFV600E突变时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因启动子区域P1和P2部分H4K16的乙酰化水平降低，然而细胞核上游增强子NUE区域乙酰化有轻度的增高。在PCCL3细胞通常中瞬时转染BRAFV600E突变体仅降低了大鼠NIS启动子区域P3和P5部分的H4K16位点乙酰化水平。人甲状腺癌细胞BCPAP中，MAPK抑制剂AZD4244，BRAF抑制剂PLX40321um处理细胞48小时，人钠碘同向转运体NIS启动子区域P1部分H3K9/14和H4K16乙酰化水平升高，SAHA提高P1和P2区域H3K9/14乙酰化水平及整个启动子区域的H4K16乙酰化水平。

主要方法 1.实验动物和细胞培养 6周龄裸鼠在实验动物中心饲养，所有动物实验均通过伦理委员会批准后执行。肝癌细胞Hep3B细胞培养Hep3B细胞培养基选用含10%FCS的DMEM低糖培养基，在温度为37°C、湿度95%，含5%CO2的细胞培养箱中培养。 2.重组腺病毒载体pAd-siRNA/FAT10的构建与鉴定 EPZ-6438溶解度从GenBank中获得FAT10的互补DNA序列，在Ambion公司的网站设计工具在线设计并合成针对FAT10的siRNA序列，然后亚克隆穿梭质粒pDC315并测序，酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pBHG1oXE1,3Cre及DOTAP脂质体共培养进行同源重组，转染HEK293细胞,包装得selleck到粗提腺病毒pAdsiRNA/FAT10。经过多轮氯化铯密度梯度纯化。标准空斑试验测定病毒液的滴度和感染效率，然后，FAT10的表达在mRNA和蛋白质水平通过RT-PCR和免疫印迹测定法(western blot)进行检测。 3.SiRNA沉默FAT10基因对Hep3B肝癌细胞的增殖、克隆时间形成、细胞周期及凋亡的影响 (1)采用MTT比色测定法分别检测Hep3B细胞增殖情况。Hep3B细胞以5×103/孔接种于96孔板中，过夜培养。分别用Ad-siRNA/FAT10(1×109PFU)或对照组处理24小时，加MTT溶液(5mg/ml)培养48h，然后在A490处测定光密度(OD)值。细胞增殖抑制率(％)=1-(实验样品OD值/对照组OD值)×100％。

DCP和c-Met在肿瘤组织中的阳性表达率均显著高于其在癌旁非肿瘤组织中的表达率。在肿瘤组织中,51%(78/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,20.9%(32/153)的病例二者的表达同时为阴性。在非肿瘤组织中,7.2%(11/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,65.4%(100/153)的病例或者二者的表达同时为阴性。在整个组织标本中,58.2%(89/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,19.6%(30/153)的病例二者的表达同时为阴性。χ2检验表明DCP和c-Met在HCC标本中的存在具有相关性。c-Met在肿瘤组织中的表达与术后HCC复发有关。c-Met结合DCP比c-M这个et单独对预测术后HCC复发的意义更显著。c-Met和DCP在HCC标本中的表达均为阴性时,该组病人术后复发率低于c-Met或DCP表达为阴性的各组患者的复发率。 结论：c-Met和DCP在HCC组织中的表达具有广泛性和一致性,与HCC术后高复发率有关。当二者表达均为阴性时,HCC患者术后复发率较低Alisertib。 第二章c-Met抑制剂抗HCC效果及机制研究 目的：探讨c-Met激酶小分子抑制剂SU11274对HCC细胞增殖的抑制作用。方法：选用高分化型HCC细胞株HepG2和HuH-7及低分化型HCC细胞株HLE, MTT法分别测定：①DCP对三种细胞增殖的刺激作用；②c-Met激酶抑制剂SU11274对三种细胞增殖的抑制作用；③同时加入DCP和SU11274对三种细胞增殖的影响。

同时我们这种逐级蛋白对接的策略能够更广泛地应用到研究其它蛋白质-蛋白质相互作用的体系。
[目的]研究鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因重排及ALK融合蛋白表达情况,探讨鼻咽癌与PLX-4720细胞系ALK基因重排的关系。 [方法]收集中国医学科学院肿瘤医院病理科2006年-2009年祖籍中国北方的鼻咽癌活检病例共99例。所有病例均为福尔马林固定、石蜡包埋组织。采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色方法,应用ALK (D5F3)单克隆这个抗体检测99例鼻咽癌ALK融合蛋白表达。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法检测99例鼻咽癌中肿瘤细胞ALK基因重排情况。 [结果]在99例鼻咽癌中,按≥15%肿瘤细胞核内出现分离信号作为诊断ALK基因重排为什么阳性的标准,FISH检测到1例发生ALK基因重排,阳性率1.0%(1/99),阴性98例；免疫组织化学示1例ALK蛋白表达阳性,阳性率1.0%(1/99),蛋白表达定位于细胞浆。FISH与免疫组织化学分析所得阳性病例为同一例,二者检测结果完全吻合。 [结论] ALK基因重排及其蛋白表达在鼻咽癌病例中阳性检出率很低。鼻咽癌与ALK基因重排的关系仍待明确。

Aurora激酶家族是一组近年来发现的调节中心体和微管功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞有丝分裂的正常进程中起着非常重要的作用。相关研究表明在一些实体肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、食管癌、结肠癌、肺癌及膀胱癌等肿瘤中均出现Aurora-A基因的高表达。目前,Aurora-A激酶作为肿瘤治疗的一个新的靶点,已经逐渐引起人们重视,其小分子抑制剂的研究和使用,尤其是与化Tariquidar分子重量疗药物的联合应用,将成为今后恶性肿瘤治疗的新方向。本文对近几年国内外在Aurora-A激酶的研究,对其生物学功能、与肿瘤的关系及其抑制剂的研究进展进行综述。
目的:了解目前国际上血液系统恶性肿瘤新药的开发研究状况。方法:根据美国药物研究与生产商协会(PhRMA)的相关报告和新药数据库等对国际上241种用于治疗血液系统恶性肿瘤候选新药的获悉更多临床研发情况进行归纳和概括,并重点对2013年进入III期临床试验或递交新药申请(NDA,BLA或获得批准)的抗白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤候选新药开发进行分析。结果:241种治疗血液肿瘤的药物分为6大类,其中用于治疗血液系统恶性肿瘤的药物24种,治疗白血病的97种,治疗淋巴瘤的98种,治疗骨髓瘤的52种,治疗骨髓增殖性肿瘤(MPNSelleck Doxorubicin)和骨髓增生异常综合征(MDS)的各15种,共进行I~III期临床试验或递交NDA(BLA或获得批准)356项。进入III期临床试验或递交NDA的治疗血液肿瘤的候选新药有56种,但有6种因各种原因终止临床试验或其NDA/BLA被驳回。结论:原创新药是国际大型制药公司或生物制药公司开发血液肿瘤新药的重点,用于新适应症或新型制剂的药物所占比例较大,生物技术类药较多,包括单抗、单抗-药物缀合制剂、β-葡聚糖和治疗性疫苗等。

在4个黄牛品种中A单倍型的频率分别是0.60,0.44,0.46,1.00。 四个多态基因座大部分群体处于中度多态(0.25一般2月龄胸围、坐骨端宽显著大于GA型个体(P0.05);AA型个体24月龄坐骨端宽和平均日增重显著大于GA型个体(P0.05)。经最小二乘分析,在秦川牛群体和郏县红牛群体中没有发现与基因座多态显著相关的性状。 在Gli3基因的E4基因座检测到TT、TC、CC三种基因型。经最小二乘分析,南阳牛群体中CC基因型的体重、胸围、坐骨端宽、日增重都要显著高于TT基因型(寻找更多P0.05)。其余各项指标基因型间差异不显著(P>0.05)。在秦川牛群体和郏县红牛群体中也没有发现与基因座多态显著相关的性状。 E5基因座检测到三种基因型AA、GA、GG,E10基因座检测到两种带型CC和TA。经最小二乘分析,E5和E10多态基因座对郏县红牛和秦川牛群体的生长发育性状没有显著影响,而Gli3基因的E5基因座在南阳牛群体中的初生重差异显著,G许多G型个体的初生重显著大于AA型个体和GA型个体(P<0.05)。E10多态基因座对南阳牛群体24月龄平均日增重有显著影响,CC型个体的二十四月龄平均日增重显著大于TT型个体(P<0.05)。
研究背景: 恶性肿瘤给人类的生存构成严重的威胁,现有治疗措施几乎都不能改变晚期恶性肿瘤复发并最终导致患者死亡的现状。由于肿瘤的侵袭以及长期治疗导致耐药仍然是当前攻克恶性肿瘤的主要障碍,因此,阐明肿瘤耐药的分子机制具有重大的理论意义及临床应用价值。