05）。通过相应信号通路抑制剂添加发现p38磷酸化被抑制后IL-8mRNA表达及因子分泌水平极显著降低（p
研究背景 还有 卵巢癌目前是死亡率最高的妇科肿瘤疾病,发病隐匿、高复发及易扩散转移是其重要的临床特征。越来越多的研究证明，恶性肿瘤组织中存在着一小部分拥有干细胞样细胞性质的群体，即肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）或称为肿瘤干细胞样细胞（cancerstem-like cells，CSLCs），其在肿瘤的发生、发展、复发及侵袭转移中起着十分重要的作用。在卵巢癌中也存在着肿瘤干细胞，即卵巢癌干细胞（ovarian cancer stem cells，OCSCs），其对卵巢癌的发生、发展、复发及转移同样具有重要作用。因此，从卵巢癌干细胞样细胞这一角度进行研究是治疗卵巢癌的新策略。 肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比，除了具有更强的侵袭、转移能力，更强的化疗抵抗能力以外，最本质的差别是其具有干细胞特性，即自我更新（self-renewal）。不管是肿瘤的发生还是复发和转移灶的形成，都有赖于肿瘤干细胞的自我更新能力。因此，阐明肿瘤干细胞的自我更新机制是研究肿瘤干细胞的关键。

肿瘤干细胞的自我更新不仅依赖于其自身内在的信号调控，同时也受到肿瘤微环境的调控，其中，肿瘤相关性炎症最为关键。然而肿瘤相关性炎症对卵巢癌干细胞的自我更新调控作用及机制却缺乏系统深入的研究。 我们前期从卵巢癌中成功分离出的CD133+卵巢癌干细胞样细胞（CD133+ovariancancer stem-like cells，CD133+OCSLCs）具有肿瘤干细胞的特性，其能够作为我们研究卵巢癌干细胞自我更新生物学特性的模型。为此，本课题探讨肿瘤相关性炎症对CD133+OCSLCs自我更新的调控作用及其机制。

AZD6738 研究目的 1．检测CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体的表达。 2．明确IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 3．阐明IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新的机制。 研究方法 围绕上述研究目的，我们采用以下研究方法： 一、CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体 1．通过人炎症反应PCR芯片（Human Inflammatory Response PCR Array）技术，比较A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌细胞系细胞)中炎症因子和相关受体mRNA的表达。 2．通过流式细胞、免疫荧光技术验证IL-17R在A2780卵巢癌细胞系，A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和人卵巢癌组织中的表达情况。 二、IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用 1．通过免疫组化，免疫荧光技术检测IL-17的来源细胞。 2．通过肿瘤干细胞成球实验及受体阻断实验研究IL-17体外对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs自我更新的作用。 3．通过构建IL-17过表达慢病毒后裸鼠体内荷瘤实验研究IL-17对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs体内成瘤能力的影响。 三、IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新作用的机制 1．通过全基因组表达谱芯片技术筛选IL-17调控A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs自我更新的相关基因并通过qPCR验证。 那个 2．结合自我更新相关基因和生物信息学方法筛选IL-17下游信号通路。 3．通过western-blot，免疫荧光和抗体阻断等方法研究NF-κB及p38MAPK两条信号通路在IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 研究结果 1．CD133+OCSLCs表面表达IL-17R 我们通过PCR-array技术，比较了A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs之间的基因差异，结合这些差异基因的生物学作用，我们选择对IL-17参与CD133+OCSLCs自我更新进行深入研究。

免疫荧光和流式细胞技术结果显示A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs表面表达IL-17R并且其表达高于非OCSLC。在新鲜人卵巢癌组织中，通过免疫荧光发现IL-17R表达于原代卵巢癌来源的CD133+OCSCs表面。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有相互作用的物质基础。 2．IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新 因为IL-17R需要与其配体IL-17相结合才能发挥功能，因此我们首先通过免疫组化检测发现人新鲜卵巢癌组织中存在表达IL-17的细胞，其主要分布于卵巢癌间质内。免疫荧光进一步证实：表达IL-17的细胞主要为CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞，并且这类细胞与CD133+OCSLCs在人卵巢癌组织中处于同一niche之中。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有空间上相互作用的可能性。 通过衡量A2780卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs在IL-17刺激后的成球数量和成球大小，证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs自我更新的作用，经过IL-17R抗体阻断实验进一步证明IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的作用依赖于IL-17R。 通过慢病毒介导的基因转染方法建立稳定表达人IL-17的CD133+OCSLCs，结合免疫荧光和ELISA验证IL-17转染效率，成球和受体阻断功能实验验证IL-17转染后促进CD133+OCSLCs自我更新。通过裸鼠体内荷瘤实验证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs体内成瘤的能力。 3．IL-17通过NF-κB和p38MAPK两条信号通路调控CD133+OCSLCs自我更新 通过基因表达谱芯片比较IL-17刺激和未刺激的卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs差异基因，在此基础上分别通过:1.筛选出8个自我更新相关基因，qPCR验证后，通过在线转录因子查找的方法，证实p65和/或AP1为8个自我更新相关基因的转录因子（除TCL1A）；2.

全基因组基因表达谱分析表明AICAR有利于J1小鼠ES细胞的多能性维持。对AICAR处理后的J1小鼠ES细胞提取RNA进行表达谱芯片分析，以寻找AICAR的下游调控基因，并进一步揭示AICAR在ES细胞干性维持中的作用。芯片数据证明，AICAR能够显著上调干性相关基因的表达，同时也能下调分化相关转录因子的表达。利用筛选得到的基因，在DAVID（Database

for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）在线软件上面进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes）分析，发现AICAR不仅能够影响AMPK通路，同时也能影响其它与J1小鼠ES细胞的干性维持相关的通路，如BMP，MAPK和TGF-β通路等。 3. AICAR可通过促进BMP通路从而拮抗RA诱导的ES细胞分化，利于其多能性维持。利用Real-time PCR对AICAR处理及未处理的细胞中Bmp2，Bmp4及其下游调控基因Ids，Coch，Dusp9进行检测，发现这些BMP通路相关基因的表达均上调。同时，AICAR还能够抑制RA诱导的上述基因表达的下调。Dorsomorphin（Dorso）是BMP通路的抑制剂，而其对AICAR作用的抑制进一步表明AICAR能够通过激活BMP通路来维持ES细胞的多能性。 selleck产品 4. AICAR影响J1小鼠ES细胞的表观遗传修饰。AICAR能够通过调控表观遗传相关基因，如Dnmt3a，Dnmt3b，Smarca2，Mbd3，Arid1a的表达，从而影响ES细胞的表观修饰状态。实验结果表明，AICAR处理后全基因组DNA甲基化（5-methylcytosine，5mC）水平下调，而DNA羟甲基化（5-hydroxymethyl cytosine，5hmC）水平保持不变。对于组蛋白修饰而言，AICAR处理导致组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化（histone H3lysine9acetylation，H3K9Ac）水平的下调和组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化（histone

H3lysine27tri-methylation，H3K27me3）水平的上调。此外，AICAR通过调控长的居间非编码RNA（long RO4929097 intervening non-coding RNA，lincRNA）的转录，从而影响ES细胞的表观遗传修饰状态。 5.小RNA（small RNA，sRNA）高通量测序结果表明AICAR能够显著影响对ES细胞发育具有重要作用的miRNAs的表达。我们对比了经AICAR处理的J1小鼠ES细胞和未经处理的J1细胞中miRNAs的表达模式，并利用Real-time PCR验证了这些差异表达的miRNAs，同时对多能性和分化相关的miRNAs和它们的靶标做了相互验证。结果表明大量多能性维持相关的miRNAs表达上调，而分化相关的miRNAs表达下调。

6. miR-134表达的下调在一定程度上促进了干性基因的表达。miR-134是分化相关的miRNA，在RA诱导的ES细胞分化过程中表达显著上升。与对照相比，AICAR处理的细胞中，miR-134的表达显著下调，而其靶标Nanog和Sox2的表达则上调。过表达miR-134导致干性基因Nanog，Oct4，Sox2和Klf4表达的下调，而AICAR的加入使靶标基因Nanog和Sox2的表达呈现回升趋势。 LY294002体内 7.靶向Myc基因的miRNAs的预测及验证。Myc在AICAR处理后显著下调。为了探索Myc基因表达下调的原因，我们利用TargetScan和miRanda两个数据库对可能靶向Myc的miRNAs进行了预测，并筛选了其中在AICAR处理后表达上调的miRNAs进行进一步的验证。结果证实miR-34a，34b，34c能够在J1小鼠ES细胞中抑制Myc的表达，而miR-135b和miR-340也可能直接靶向Myc基因mRNA的3非编码区（untranslatedregion，UTR）调控其表达。 总之，本研究表明AICAR的加入利于J1小鼠ES细胞的自我更新和多潜能性的维持，这将为ES细胞在医学上的研究及应用提供一定的理论基础。
第一章早期培养对人类胚胎干细胞(hESCs)遗传稳定和基因表达的影响 目的：既往的研究发现在长期培养的hESCs(>P30)中会发生一些遗传和表观遗传的改变,然而,对于P30以前是否也发生了一些改变目前知之甚少,我们的研究目的在于利用我们胚胎干细胞库的丰富资源,评估hESCs在分离后的早期培养过程(20代以前)的遗传学改变和基因表达的改变。 材料和方法：利用我们胚胎干细胞库的胚胎干细胞资源,分别选取核型正常的分离初始期(P4-P9)和早期(P20-P30)hESCs,其中5株进行SNP芯片用于分析遗传变化,12株行全基因组表达谱芯片用于分析基因表达变化。 结果：从我们选取的细胞库中核型正常,并已完成各项检查的12株hESCs的初始期和早期未分化样本进行的以上实验可得到以下结果(1)SNP芯片分析结果可知,有一些小片段的缺失和重复,这些片段的平均大小约为100kb,且不存在规律性的改变。(2)从表达谱的分析来看,在两个阶段的样本间平均仅有0.10士0.

雌激素影响LPS诱导的大鼠BMSCs表达OPG/RANKL的炎性因子调控途径

加入LPS、E2，并分别加入TNF中和性抗体anti-TNF-α，antiIL-1β，以及IL-6可溶性受体sIL-6R。分别培养6h、12h、24h、48h和72h后，收集细胞培养上清液进行OPG和RANKL的ELISA检测。 结果显示，加入antiTNF-α、antiIL-1β和sIL-6R后，OPG表达与单纯加入E2无明显差别，与加入LPS和E2比较略有下降，至24h达高峰，随后逐渐下降；RANKL的表达与单纯加入LPS相比，以及与加入LPS和E2相比，均有不同程度的下降，其中以加入sIL-6R后最为明显，至24h表达水平达到最高峰。 结论： 1.通过大鼠全骨髓贴壁筛选法可以对BMSCs进行分离、纯化、培养和扩增，将其生物学特性和流式细胞术检测表型特征相结合，可以鉴定为大鼠BMSCs。 2.LPS可以诱导BMSCs分泌表达炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6，雌激素可以显著抑制炎性因子的高表达，并且呈浓度依赖性，表明雌激素具有明显的抗炎作用。 3.LPS和雌激素共同刺激下的BMSCs炎性因子表达量6h时处于上升期，12h和24h处于高峰，48h和72h时表达下降，表现为明显的时间依赖性。 4.MAPK信号通路可能是雌激素调控BMSCs炎性因子表达的途径之一。 5.雌激素可以明显促进BMSCs中OPG的表达，LPS可以明显促进BMSCs中RANKL的表达，雌激素可以通过调控OPG/RANKL的比值提高LPS作用后BMSCs的骨向分化能力，促进炎症微环境下BMSCs的骨向分化。 很少 6.经LPS与E2作用后，大鼠BMSCs的OPG表达在6h开始上升，12h到24小时到达高峰，随后下降，而RANKL的表达在6h上升，12h以后一直保持较高水平。 7.雌激素可以通过调控炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达的途径对LPS诱导的BMSCs表达OPG/RANKL进行调控，雌激素调控炎性因子的表达是其发挥生物学功能的途径之一。
肺纤维化是严重危害健康的呼吸系统常见并发症,是各种不同病因的肺间质疾病的最后共同结局。由于大部分肺部疾病的最终转归都伴有不同程度的肺纤维化,因此肺纤维化不仅是肺部疾病转归的结果,还是导致原有疾病进一步恶化的主要原因。目前肺纤维化的临床治疗以给予皮质类固醇类和其他免疫抑制剂药物为主,但是研究发现其只对部分肺纤维化患者有效,对特发性肺纤维化患者疗效较差。肺纤维化的发病率和死亡率近年呈逐渐上升态势,对人类健康危害极大。因此,寻找新的治疗策略迫在眉睫。 Antiflammin-1(AF-1)是与子宫珠蛋白(uteroglobin, UG)第三个alpha螺旋中的保守序列高度同源的一段寡肽,由于最初发现在体内具有较强的抗炎作用而得名。AF-1由九肽组成,对应于UG分子中的第39～47位氨基酸(MQMKKVLDS)。研究证实,AF-1具有抗炎、抑制细胞趋化及粘附等多种与UG相似的生物活性。与大分子天然蛋白UG相比较,

JQ1溶解度 AF-1的分子量更小,免疫原性更低,因此具有潜在的应用前景。以往的研究集中在对AF-1的抗炎作用和机制的探索上,鉴于UG在肺纤维化发生发展中的重要作用和本课题组前期关于AF-1抑制转化生长因子betal (transforming growth factor-betal,TGF-β1)诱导的NIH3T3增殖的作用,本课题首先在整体实验部分探索AF-1是否具有抑制博来霉素(bleomycin, BLM)诱导的小鼠急性肺炎症反应和抗肺纤维化的作用。 我们在前期实验中发现,UG的活性片段AF-1也能够特异性地结合UG受体,并且通过UG受体的介导,AF-1能够特异性的调节小鼠成纤维细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated

protein kinase, MAPK)信号途径。由于UG受体同样表达于肺泡上皮细胞上,那么,既然AF-1能够通过结合成纤维细胞膜上的UG受体而抑制TGF-β1促增殖的作用。那么是否AF-1同样能通过上皮细胞膜上的UG受体而发挥某种生物学功能?本课题进一步在细胞实验部分尝试观察：①AF-11是否能够抑制TGF-β1诱导的上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal selleck compound library transition, EMT)的作用?②如果能,是否同样依赖于UG受体的介导? 第一章AF-1抑制博来霉素诱导的急性肺损伤 方法： 将60只实验小鼠随机分为3组,A组为生理盐水组,B组为BLM组,C组为BLM+AF-1组。单次给予小鼠气管内注射BLM(5mg/kg)以造成小鼠急性肺损伤,每日腹腔注射AF-1(2mg/kg),于BLM给药7天后收集样本,检测肺湿干重比值,HE染色法观察小鼠肺组织病理形态学变化,ELISA法检测肺组织匀浆TGF-β1、白介素-1beta(interleukin-1β, IL-1β)及肿瘤坏死因子-alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的浓度,肺组织匀浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的检测,肺泡灌洗液中细胞分类计数、蛋白含量及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性的检测。 结果：(1)气管内注射BLM(5mg/kg)后第7天,BLM组肺湿干重比值、肺系数及MPO活性较正常对照组显著增加(P<0.05),经AF-1处理后,肺泡灌洗液中LDH活性和蛋白含量较BLM组明显下降(P<0.05)。经AF-1处理后,肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞的数量和百分比、淋巴细胞的数量较单独给予BLM组明显下降(P<0.05),经AF-1处理后,小鼠肺组织中TGF-β1、IL-1β、TNF-α的水平的显著下降,与单独给予BLM组相比,差异具有统计学意义(P<0.

84±0.11μmol.mg~(-1).min~(-1)上升到1.68±0.07μmol.mg~(-1).min~(-1)(p＜0.01)，而K_m则由23.54±0.12mmol／L减小到20.86±0.13mmol／L(p＞0.05)。激酶抑制剂阻断表明Na~+，K~+-ATPase的磷酸化是ALR提高其转化效率的关键因素，其中以丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化为主。抗ALR单克隆抗体能有效阻断ALR提高HepG2细胞Na~+，K~+-ATPase的酶活。

哪里 荧光探针分析表明：ALR能提高线粒体膜电位，增加细胞内游离[Ca~(2+)]浓度，清除细胞内活性氧。ALR能减缓因Na~+，K~+-ATPase活性下降而造成的对细胞线粒体膜电位的抑制和细胞内游离[Ca~(2+)]浓度的下调，有助于细胞内活性氧的清除。 在分子水平上，在50μg／L～200μg／L范围内，ALR能够浓度—时间效应激活MAPK通路，最大激活时间是10min。以浓度效应方式上调细胞周期蛋白CyclinD1表达水平，降低p21表达，提高pRb磷酸化水平。即：ALR通过调控MAPK途径和细胞周期蛋白的作用促进HepG2细胞增殖。用奎巴因抑制Na~+，K~+-ATPase活性，能下调ALR引起的ERK磷酸化水平，上调p38的磷酸化；同时导致Cyclin D1蛋白下调，升高p21表达，pRb蛋白活性下降，表明其抑制了
背景与目的 还有 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一；国内外研究结果显示导致HCC的主要危险因素包括了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、家族遗传因素等，这些致肿瘤的内外因素可能通过引发机体原癌基因的激活或抑癌基因的失活、细胞周期的紊乱、细胞分化发乱异常、细胞凋亡障碍、信号转导路异常等等起作用；对HCC的信号转导通路的研究显示多种信转导通路的异常参与了HCC的发生与发展；MAPK作为信号从细胞表面到细胞核内部的一条重要的传递途径。有研究显示MAPK通路的异常可能参与了HCC的发生与发展。本研究拟对大鼠及人HCC的肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织及大鼠HCC形成前的活检肝组织的MAPK通路的ERK1/2、JNK和p38基因mRNA的表达情况及蛋白质活性进行检测，以了解MAPK通路在HCC发生发展过程中的作用，为进一步防治HCC提供理论基础。 材料与方法 1) 实验材料： 实验大鼠80只，随机分为2组，实验组(AFB1组)为66只，对照组为14只。AFB1实验组大鼠24例发生HCC；对24例HCC大鼠的肝癌组织、癌旁组织及癌前定期活检肝组织；选取未出癌大鼠6例及对照组大鼠11例的同期活检肝组织；另外，收集52例人HCC患者的肝癌组织及癌旁肝组织、18例正常人肝脏组织作为实验材料。

2) 实验方法： 采用逆转录PCR(RT-PCR)、免疫印迹试验(Western Blotting)及免疫
扇贝多肽(PCF)是从海洋生物栉孔扇贝(Chlamys farreri)中得到的水溶性多肽。本文首先通过复制小鼠的地塞米松免疫抑制模型,采用免疫组织化学、MTT法和流式细胞仪的方法,探讨扇贝多肽在体内对胸腺细胞和外周血淋巴细胞增殖和分化的作用。在此基础上,通过正交设计实验方案,筛选出适宜的紫外线辐照参数,建立了紫外线对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的病理模型。实验设计分组为:对照组,紫外线照射模型组,紫外线+0.125%PCF组,紫外线+0.25%PCF组,紫外线+0.5%PCF组和紫外线+0.1%VitC组。通过采用MTT法检测淋巴细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构的改变;琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带特征性变化;酶生化法测定细胞胞浆内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量以及细胞抗超氧阴离子能力(A-SAC)和总抗氧化能力(T-AOC);流式细胞仪测定细胞凋亡率;Fluo-3-AM荧光染色测定细胞内游离[Ca2+]I的变化;Rhodamine

许多 123荧光染色测定线粒体膜电位(ΔψМ)的改变;免疫细胞化学检测细胞p53、Bcl-2、Bax基因蛋白的表达;PT-PCR检测c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达;原位杂交检测细胞P21WAF1 mRNA、P38 mRNA的基因表达;琼脂糖凝胶电泳观察各组不加入或分别加入ERK抑制剂、JNK抑制剂和P38抑制剂后的DNA ladder的变化;western-blot检测磷酸化ERK、磷酸化JNK、和磷酸化P38的活性等方法,探讨在紫外线照射下,扇贝多肽(PCF)对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的保护作用及机制。 实验结果表明,PCF腹腔注射能够明显增强小鼠胸腺淋巴细胞转化能力,并促进DEX处理小鼠外周成熟的淋巴细胞增殖;在紫外线强度为6.16mJ/cm2,照射时间为10秒的照射条件下,建立了紫外线对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的病理模型;0.125-0.

5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L亚砷酸钠处理12小时和24小时后MDM2、p53和丝氨酸15位磷酸化的p53蛋白的表达水平,并且与5-Fu和紫外线处理作比较。采用细胞免疫荧光染色法研究砷剂处理前后p53蛋白的亚细胞定位及细霉素B和Nutlin-3预处理对其影响。 结果:低浓度砷剂上调了角质形成细胞中MDM2蛋白的表达,但对p53蛋白表达无明显影响。随着低浓度砷剂剂量的逐渐增加,MDM2蛋白的表达水平亦逐渐增加;随着砷剂作用时间的逐渐增加,MDM2蛋白的表达水平也逐渐增强。低浓度砷剂处理后角质形成细胞p53蛋白主要分布在胞浆。细霉素B和Nutlin-3预处理可以阻断砷剂诱导的p53胞浆分布。先用低浓度砷剂处理角质形成细胞后再加5-Fu刺激,此时5-Fu激活p53功能受到明显的抑制。 结论:低浓度砷剂呈剂量和时间依赖性上调角质形成细胞中MDM2蛋白的表达;低浓度砷剂可经由上调MDM2蛋白表达介导p53的胞浆分布;低浓度砷剂诱导的p53胞浆分布导致p53功能性失活。 第二章低浓度砷剂上调MDM2的机制探讨 目的:探讨低浓度砷剂上调MDM2表达的作用机制。

方法:构建pGL3-MDM2基因启动子报告基因表达载体,采用荧光素酶报告基因分析方法观察亚砷酸钠对MDM2基因P1、P2启动子转录活性的影响。应用1μmol/L和2μmol/L亚砷酸钠处理皮肤角质形成细胞24h后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MDM2 LEE011浓度 什么 mRNA的表达水平。应用PD98059、SB203580和LY294002等特异性信号转导通路抑制剂预处理后再观察砷剂对角质形成细胞MDM2表达的影响。

结果:低浓度砷剂可显著诱导MDM2基因P1启动子的荧光素酶活性(P＜0.05)。随着低浓度砷剂的剂量逐渐增加,MDM2 mRNA的表达水平逐渐增高。PD98059预处理可完全阻断砷剂上调角质形成细胞中MDM2的表达,而SB203580和LY294002预处理对砷剂诱导的MDM2表达上调无明显影响。 结论:通过MAPK/ERK信号转导通路,低浓度砷剂激活MDM2基因P1启动子的转录活性,从而诱导MDM2的表达。 第三章低浓度砷剂通过功能性失活p53发挥辅助致癌作用 目的:探讨低浓度砷剂对紫外线引起角质形成细胞凋亡的影响及其与砷性皮肤癌作用机制的关系。 方法:应用0.5μmol/L和1μmol/L亚砷酸钠处理角质形成细胞24h后,再用40mJ/cm~2紫外线照射。采用流式细胞术和Hoechst33258胞核染色检测砷剂和UV引起的细胞凋亡。 结果:0.5μmol/L和1μmol/L砷剂处理角质形成细胞后凋亡率分别为1.2%和1.5%,与正常对照组1.5%无显著性差异(P＞0.05)。而先经过0.5μmol/L和1μmol/L砷剂预处理后的角质形成细胞再照射紫外线,此时凋亡率分别为48.8%和39.9%,与未经砷剂预处理直接照射UV组凋亡率64.7%相比有显著性差异(P＜0.05)。表明砷剂预处理可导致角质形成细胞对UV的凋亡抗性。Hoechst33258核染色结果与之相一致。

结论:低浓度砷剂暴露可损害皮肤角质形成细胞对紫外线引起的凋亡反应;低浓度砷剂可通过功能性失活p53从而发挥其辅助致癌作用。
一、前言 胃癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国是死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前胃癌的治疗一般采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等综合措施,其中化疗具有手术和放疗不能替代的地位。但肿瘤细胞的耐药性,尤其是肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)常导致化疗失败。据统计,晚期胃癌患者化疗有效率约为20%～40%,生存率平均6～12个月。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并对其产生耐药后,同时对其它化学结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药。 转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGFβ)超家族是一类结构相似但功能不同的肽类物质,在肿瘤的发展过程中,其作用机制较为复杂。我们的早期研究发现TGFβ1除了明显促进胃癌细胞的浸润及转移外,还可显著增加SGC-7901细胞中谷胱甘肽S转移酶π(GST-π)的表达,且胃癌组织中TGFβ1与GST-π的表达水平呈正相关。有研究表明,GST-π表达水平的改变与化疗耐药有关,由此提示TGFβ1可能参与了胃癌细胞的耐药过程,但迄今为止尚未见TGFβ1与胃癌耐药相关的报道。 也许 二、目的 本课题以TGFβ1处理SGC-7901细胞,观察其对化疗药物敏感性的变化,然后利用siRNA、蛋白质组学,Western blotting等技术分析可能参与此过程的信号分子,以探讨TGFβ1促胃癌耐药的分子机制,为临床克服耐药现象提供新的干预靶点。 三、方法与结果 1、利用MTT法检测经TGFβ1预处理过的SGC-7901和未经TGFβ1预处理过的SGC-7901对丝裂霉素的敏感性,结果发现:丝裂霉素对SGC-7901细胞的抑制率为89.5±10.6%;经10ng/ml TGFβ1预处理后,丝裂霉素对SGC-7901细胞的抑制率降为35.0±4.1%,二者间有显著性差异(反应细胞增殖情况OD490值的比较,均P＜0.

5%乙醇溶液。在实验期间每天定时观察各组小鼠进食、饮水、毛色、活动及大便性状，称量体重，观察大便隐血情况，并进行疾病活动指数评分（DAI），至造模第8天全部小鼠均处死，收集小鼠结肠组织，一部分用于石蜡包埋切片，HE染色，并观察组织病理学损伤情况,行组织学评分；另取两份组织保存于液氮中备用。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测结肠黏膜组织肿瘤坏死因子（TNF）-α、髓过氧化物酶(MPO)的表达；应用免疫组织化学染色观察结肠组织p-p38MAPK的表达情况及逆转录转氨酶链聚合反应（RT-PCR）方法检测结肠组织内p38MAPKmRNA的表达。结果：1.B组小鼠症状、组织学检查均符合UC诊断标准，且DAI及组织学评明显高于A组，经过地塞米松和姜黄素干预后，C组、D组、E组和F组DAI及组织学评分有不同程度的降低。2.ELISA结果：

或者 B组结肠黏膜中TNF-α、 MPO的含量分别为（382.26±21.82、339.31±13.61）明显高于C组（257.42±19.04、238.95±11.17）、D组（333.67±17.72、298.93±9.94）、E组（287.89±19.57、258.60±13.07）和F组（271.10±13.25、248.52±9.24），有统计学差异（P均＜0.01），C组的含量显著低于D组、E组的含量，有统计学差异（P＜0.05），C组同F组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；E组、F组较D组含量低，差异有统计学意义（P＜0.05），F组较E组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。3.免疫组织化学法结果：B组小鼠结肠黏膜p-p38MAPK表达（6.80±0.77）明显高于A组（0.52±0.32），差异有统计学意义(P＜0.01)，经地塞米松及姜黄素低、中、高剂量干预后,C组(2.50±0.82)、D组（4.36±1.02）、E组（3.62±0.79）、F组（3.12±0.63）均较B组有显著降低，有统计学差异（P＜0.01），C组表达明显低于D组、E组，差异有统计学意义（P＜0.05），D组较E组、F组升高（P值均＜0.05），E组与F组差异无统计学意义（P＞0.05）。4.RT-PCR结果：B组结肠组织内p38MAPK mRNA明显高于A组，C组、D组、E组和F组均较B组有不同程度的降低，其中以F组表达最低。结论：姜黄素对DSS诱导的小鼠急性期UC有一定治疗作用，可能是通过抑p38MAPK信号通路，减少TNF-α等促炎因子的释放，减轻中性粒细胞的浸润，从而减轻UC小鼠肠粘膜炎症损伤而发挥治疗UC作用。
目的：我们的前期实验证实ANP32A在心肌细胞中有表达。敲减ANP32A在心肌细胞中的表达可抑制多柔比星诱导的心肌细胞凋亡。MAPKs在多柔比星诱导的心肌细胞凋亡中起重要作用。我们假设：敲减ANP32A经MAPKs通路抑制多柔比星诱导的凋亡。

R428临床试验 方法：原代心肌细胞培养并运用肌钙蛋白I（cTnI）对其进行鉴定。实验分组：正常心肌细胞组（CMs组）、多柔比星（DOX）组、空载病毒（NC-LV）组、空载病毒+多柔比星（NC-LV+DOX）组、目的基因病毒（Anp）组、目的基因+多柔比星（Anp+DOX）组。将构建的lentivirus-scrRNAi和lentivirus-ANP32A/GV115-RNAi载体分别转染入NC-LV组、NC-LV+DOX组和Anp组、Anp+DOX组。转染72h后应用免疫荧光法检测其转染心肌细胞的效率，并于DOX组、NC-LV+DOX组和Anp+DOX组加入多柔比星（1μmol/L）作用12h建立心肌细胞凋亡模型，应用AnnexinV-FITC法检测6组心肌细胞凋亡率，以心肌细胞凋亡率作为心肌细胞凋亡的观察指标，观察敲减ANP32A对多柔比星诱导的心肌细胞凋亡的影响。运用Westernblot法检测CMs组、DOX组、Anp组和Anp+DOX组的ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、P38MAPKs、p-P38MAPKs蛋白表达水平。数据运用SPSS13.0统计软件包进行多组间单因素方差分析和组间t检验。

所以 结果：体外原代培养的心肌细胞，呈多边形、梭形等，部分细胞聚集成细胞簇，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，搏动频率多为60-100次/分。对细胞进行cTnI鉴定显示95%以上细胞呈阳性表达，符合心肌细胞特征。转染NC-LV和ANP32A敲减重组慢病毒心肌细胞72h后，荧光显微镜观察分别发现90%和80%以上的心肌细胞表达绿色荧光蛋白。分析AnnexinV-FITC法测定DOX组和CMs组心肌细胞凋亡率[（31.94±1.24）%vs（3.62±0.53）%,（p0.05）]、[（33.14±1.57）%vs（31.94±1.24）%,（p>0.05）]，提示慢病毒对心肌细胞的毒性不影响结果分析；分析Anp+DOX组与DOX组凋亡率[（16.62±2.07）%vs（31.94±1.24）%,（p0.05），说明多柔比星未引起ERK1/2活性的变化；DOX组与CMs组p-JNK/JNK比值高了1.5倍，差异有统计学意义（p
目的： 1.观察TNF-α对RAFLS的Ras-p38MAPK信号通路活化水平的影响。 2.观察不同浓度的ATO对TNF-α诱导的Ras-p38MAPK信号通路活化水平的影响。 方法： 1.从RA患者的膝关节腔积液中获取标本进行原代培养RA FLS细胞。培养至第3代即获得纯化的RA FLS细胞。 2.使用10μg/L的TNF-α与第3代RA FLS共孵育30min，运用Western-blot检测其与空白对照组的Ras、p-p38的表达水平。 3.将三种不同浓度的ATO（0.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L）与RAFLS细胞共孵育24h，然后终止反应，将10μg/L TNF-α与之共孵育30min，终止反应进行Western blot检测每个组的Ras、p-p38的表达水平。 结果： 1.原代培养有较多的巨噬细胞，随着传代的进行，其逐渐被去除。到第三代培养的细胞基本上都是RA FLS细胞。 2.TNF-α刺激后的RAFLS，通过Western blot检测表明Ras, p-p38表达水平明显升高。（p
目的： 研究天麻素对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用及其相关机制。 方法： 采用谷氨酸建立PC12细胞损伤模型，MTT比色法测定细胞活力并确立谷氨酸最佳造模浓度。采用倒置显微镜观察细胞形态变化；MTT法检测细胞活力；AO/EB双染法和Hoechst荧光染色法观察细胞凋亡形态；流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的变化以及Annexin V/PI染色后细胞凋亡率；罗丹明123染色法检测线粒体跨膜电位；Western blotting法分析p-p38，p-ERK1/2及caspase-3蛋白的表达。 结果： 1.

5%、48%。NALP3-siRNA组IL-1β mRNA表达降低23%、ASC-siRNA组降低了39%。ELISA结果显示NALP3-siRNA组IL-1β和IL-18的表达分别减少27.7%、21%，ASC-siRNA组IL-1β和IL-18的表达分别减少44.1%、40.1%。Western

很少 blotting结果发现p38磷酸化水平与对照组无明显差异。 （5） Caspase-1抑制剂能降低IL-1β、IL-18的表达，分别降低41.9%和37.2%；p38抑制剂使IL-1β、IL-18表达降低，分别降低29.6%和37.8%，NALP3、ASC、Caspase-1及IL-1β的mRNA表达分别减少23%、31%、13%和23%。 结论: （1）pORF5质粒蛋白可通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-18。 （2）pORF5质粒蛋白激活的p38MAPK信号通路能够影响NALP3炎性复合体的激活。
胃癌是世界各地最为常见的恶性肿瘤之一，在我国，其发生率和死亡率占恶性肿瘤的第二位，侵袭和转移是导致胃癌患者死亡的主要原因。因此，深入探讨引起增加胃癌侵袭与转移的作用及机制,进一步抑制胃癌细胞的侵袭转移,对于胃癌的临床治疗与预后具有深远的意义。白细胞介素-1β（IL-1β）已被证实与胃腺癌的发生、发展密切相关，但其分子机制尚不清楚。p38蛋白激酶是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族的主要成员之一，是调控IL-1β信号通路的主要激酶。因此，我们着眼于研究p38蛋白激酶在IL-1β介导的胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用及其机制。目前尚未见相关文献报道。 目的：探讨IL-1β介导的p38蛋白激酶在胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用，并从细胞水平、临床样本、动物水平三方面初步探讨其作用机制，旨在阐明其作用及机制并为胃腺癌患者寻找一种新的治疗方法提供良好的实验依据。 方法： 1、应用Western blot技术在胃腺癌细胞株中验证IL-1β是否能激活p38蛋白激酶； 2、应用RNA干扰技术(siRNA技术)结合p38信号途径特异性抑制剂SB202190和Transwell迁移侵袭实验检测IL-1β激活p38蛋白激酶对胃腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；

3、应用siRNA技术结合p38信号途径特异性抑制剂SB202190和RT-PCR检测IL-1β激活p38蛋白激酶对胃腺癌细胞中MMP2、MMP9mRNA表达的影响； 4、应用siRNA技术，通过转染MMP2siRNA、MMP9siRNA以及MMP2/MMP9siRNA和应用MMP2/9抑制剂BiPS进一步检测IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的可能机制是否涉及MMP2和MMP9； Selleckchem DAPT 5、应用免疫组化技术检测人胃腺癌组织样本中磷酸化p38（p-p38）的表达及其表达强度与IL-1β、MMP2、MMP9表达强度之间的相关性； 6、应用siRNA技术结合动物实验、RT-PCR和免疫组化技术检测敲减p38再接受IL-1β刺激前后裸鼠胃癌肺转移结节数及裸鼠胃癌肺转移组织中p38/p-p38、MMP2、MMP9mRNA和蛋白质的表达。 结果： 1、IL-1β的刺激，可激活胃腺癌细胞AGS和MKN-45的p38蛋白激酶Western blot结果显示：在IL-1β刺激后30min，两株胃腺癌细胞AGS和MKN-45中的p38蛋白激酶均可被IL-1β激活，发生磷酸化；p38抑制剂SB202190预作用于细胞3h后再用IL-1β刺激，

p38蛋白激酶磷酸化则被抑制，表明IL-1β激活p38蛋白激酶具有较强的特异性。 2、IL-1β激活p38蛋白激酶可增加胃腺癌细胞AGS和MKN-45迁移和侵袭能力Transwell测定结果表明：接受IL-1β刺激后，胃腺癌细胞AGS和MKN-45迁移和侵袭作用增强，与未接受刺激的细胞相比，差异具有统计学意义(p﹤0.05)；转染p38siRNA或用p38抑制剂SB202190预处理细胞，则胃腺癌细胞上述作用明显减弱，表明IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的作用是通过激活p38蛋白激酶。 3、IL-1β激活p38蛋白激酶通过上调MMP2和MMP9的表达增加胃腺癌细胞迁移和侵袭RT-PCR测定结果表明，IL-1β刺激后，胃腺癌AGS和MKN-45细胞中的MMP2和MMP9的mRNA表达增加，与未接受刺激的细胞相比，差异具有统计学意义(p﹤0.05)；转染p38siRNA和用p38抑制剂SB202190预处理的胃腺癌细胞接受IL-1β刺激后，MMP2和MMP9的mRNA表达降低。上述结果初步表明IL-1β激活p38蛋白激酶增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的机制涉及上调MMP2和MMP9。 ISRIB价格 4、Transwell测定结果表明：与siRNA阴性对照转染组比较，MMP2siRNA转染组和MMP9siRNA转染组以及MMP2/MMP9抑制剂BiPS预处理组的胃腺癌细胞接受IL-1β刺激后迁移和侵袭能力明显减弱，结果进一步表明：IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的机制涉及上调MMP2和MMP9。 5、免疫组化结果表明：在105例测定的胃腺癌样本中，与配对非癌组织样本比较，53例胃腺癌组织(50.48%)过表达磷酸化的p38(p-p38)。p-p38的过表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤分化程度无关(p﹥0.05)，但与淋巴结转移和肿瘤侵袭程度（至浆膜外）密切相关(p﹤0.05)。同时，p38的过表达与IL-1β, MMP2, MMP9的高表达具有显著的相关性(r=0.72, p﹤0.01; r=0.63, p﹤0.01; r=0.58, p﹤0.

SIK1在糖尿病肾病大鼠肾脏的表达和意义 将SPF级8周龄wistar大鼠随机分为正常对照组(normal组,10只)和糖尿病组(diabetic组,20只)。糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ,溶于pH值4.5的0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,60mg/kg),对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后尾尖取血,血糖≥16.7mmol/L者确定为1型糖尿病模型。于12和16周龄糖尿病模型组取5只大鼠,乙醚麻醉大鼠,眼球内眦取血,离心分离血清,用于测定血糖；称重后于腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠麻醉,分离肾脏。于20周龄,将各组大鼠于代谢笼中,监测24h尿量,尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)水平,并计算内生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)。麻醉取血,分离血清测定血糖,血肌酐及尿素氮水平。摘取肾脏,称重,计算肾脏指数。取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,用于HE,

PAS染色观察其病理变化情况。 取肾组织制备切片进行免疫组化。分别提取肾组织及肾小球组织蛋白,应用免疫沉淀及Western blot方法以及观察糖尿病大鼠肾脏SIK1蛋白表达及磷酸化水平的影响。并应用Western blot方法观察20周龄大鼠肾小球ALK、FN. PAI-1表达情况,Masson染色观察20周龄大鼠肾小球胶原纤维及ECM聚集情况。 2.高糖刺激对系膜细胞SIK1的表达、活性、细胞内分布及ALK5信号通路的影响,SIK1表达质粒对高糖刺激下的系膜细胞ALK5信号通路及系膜细胞增殖的影响 很少 大鼠肾系膜细胞HBZY-1细胞以含有10%胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,用高糖(30mmol/L, 所以 High glucose, HG)制备模型,于刺激后0、12、24和48h收集细胞,免疫沉淀、Western

blot及半定量RT-PCR分别检测SIK1表达及磷酸化水平。构建pEGFP-SIK1表达质粒,激光共聚焦观察高糖刺激下细胞内生性及转染pEGFP空质粒及pEGFP-SIK1表达质粒后SIKl细胞内分布及核转运情况。Western blot及免疫细胞化学观察高糖对HBZY-1细胞ALK5信号通路的影响。 设计和构建针对SIK1基因的表达质粒,将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,同步化后将细胞随机分为3组,空白细胞对照组、pCDF1空质粒对照组和pCDF1-SIK1质粒转染组,24h后细胞长至70-80%时开始转染,转染采用阳离子脂质体法。48h后荧光显微镜观察转染效率,终止培养进行蛋白、RNA提取。Western blot及半定量RT-PCR检测细胞内SIK-1蛋白和mRNA的表达。对各组转染成功细胞以高糖继续培养48h,终止培养后以Western blot及细胞免疫组化检测SIK1、ALK5、FN及PAI-1表达,MTT法检测细胞增殖情况。 [结果] 1.SIK1在糖尿病肾病大鼠肾脏的表达和意义 (1) wistar大鼠腹腔注射STZ成功建立1型糖尿病模型。与正常对照组比较,模型组表现出多饮、多食及体重减轻的特点。20周龄时,模型组餐后血糖水平升高,但血甘油三酯及胆固醇水平正常。与正常对照组相比,模型组出现糖尿病肾病的明显特征,各肾功能指标均表现出显著性差异。糖尿病模型组24h尿量、肾体重比、尿白蛋白分泌率、血肌酐,肌酐清除率,血尿素氮指标水平均明显升高,并出现肾小球肥大、纤维化,基底膜增厚等病理改变,肾小球面积及系膜增殖指数明显增大。 (2)免疫组织化学检测发现,SIK1在正常大鼠肾脏的肾小球及远曲小管表达明显,在近曲小管表达较少,且在各细胞的胞浆无着色,胞核无着色。在糖尿病模型组大鼠中,SIKl在肾小管的表达与正常对照组一致。而在肾小球的随病程月数的增加,SIK1的表达依次减少,呈时间依赖性。Western

blot检测发现,在糖尿病大鼠肾组织SIK1的表达在三个时间点无明显变化,与正常对照组大鼠20周龄一致。而肾组织SIK1磷酸化水平在三个时间点却依次减少,且均明显低于正常对照组大鼠20周龄肾组织SIK1磷酸化水平。分离肾小球提取蛋白发现,糖尿病大鼠肾小球SIK1的表达在三个时间点表达却依次减少,均明显低于正常对照组大鼠20周龄肾小球SIK1的表达。 还有 (3)与正常对照组大鼠相比,Western blot检测发现20周龄糖尿病大鼠肾小球ALK5、FN、PAI-1表达明显增高,Masson染色观察发现糖尿病大鼠肾小球肾小球胶原纤维及ECM明显聚集。 2.高糖刺激对系膜细胞SIKl的表达、活性、细胞内分布及ALK5信号通路的影响,SIK1表达质粒对高糖刺激下的系膜细胞ALK5信号通路及系膜细胞增殖的影响 (1)高糖刺激后0、12、24、48h,经免疫沉淀及Western blot检测发现,SIK1的表达及磷酸化水平依次递减,呈时间依赖性,有统计学意义。细胞免疫荧光后激光共聚焦观察发现SIK1在HBZY-1细胞的核内外均匀表达,高糖刺激下表达减少并向细胞内转运。转染pEGFP-SIKl表达质粒后,激光共聚焦观察发现GFP荧光信号在高糖刺激下由核外向核内转移。 (2)高糖刺激后0、12、24、48h,经Western blot检测发现,ALK5、FN、PAI-1表达水平依次递增,呈时间依赖性,有统计学意义。相对于高糖刺激后0h,细胞免疫组化发现在高糖刺激48h后FN、PAI-1表达水平明显增高。 (3)经酶切鉴定和测序分析,质粒符合设计要求,命名为pCDF1-SIK1。转染HBZY-1细胞24h后荧光倒置显微镜可见绿色荧光蛋白表达,48h表达量达60%以上。相对于正常对照组及pCDFl空质粒对照组,半定量RT-PCR及Western blot检测提示pCDFl-SIK组mRNA水平分别增加1.81和1.86倍,蛋白水平分别增加1.81和2.06,继续高糖刺激48h后,Western blot检测提示pCDF1-SIK组ALK5蛋白水平降低37.

7巨噬细胞表面受体CD14、胞内信号转导分子p38 MAPK、iNOS及炎症介质TNF-α、NO表达的动态变化,探讨槐定碱抗内毒素性炎症反应的机制。 方法用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,建立细胞炎症反应模型,实验细胞分为8组(n = 6):空白对照组、LPS模型1组、LPS模型2组、槐定碱干预组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组、SB203580组、SB203580

+槐定碱干预组。槐定碱剂量15.63 mg·L~(-1)。MTT法测定槐定碱最大无毒浓度(TC0);反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38及iNOS mRNA表达;Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p-p38及iNOS蛋白的表达;硝酸还原酶法测定细胞培养液一氧化氮(NO)含量;放射免疫分析法检测细胞培养液肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。 没有 结果( 1)Reed Muench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0=200 mg·L~(-1)。(2)与空白对照组比较,LPS模型1组各时间点CD14、p38、iNOS mRNA与CD14、p-p38、iNOS蛋白表达均显著增高(P<0.01或P<0.05),但仍高于空白对照组(P<0.05或P<0.05或P<0.01或P<0.05),但仍高于空白对照组(P<0.01或P<0.05),但均高于空白对照组(P<0.01);与LPS1组比较,槐定碱干预组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组(P<0.05或P0.05); SB203580组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组(P<0.05或P<0.01);SB203580+槐定碱干预组NO、TNF-α释放量多低于同时间点SB203580组(P<0.05或P0.05),表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有时间依赖性。 (5)与LPS1组比较,槐定碱31.25 mg·L~(-1)、15.63 mg·L~(-1)剂量干预组均可下调NO、TNF-α释放量(P<0.05或P0.05);SB203580组NO、TNF-α释放量均低于LPS1组(P<0.05或P0.05);表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有剂量依赖性。 已经 结论(1)Reed Meuench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0= 200mg·L~(-1)。 (2)槐定碱抗内毒素效应与其下调LPS诱导的CD14、p38、iNOS的转录、翻译及蛋白磷酸化水平及直接拮抗内毒素作用有关。

(3)槐定碱抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO、TNF-α的效应具有时间依赖性和剂量依赖性。 (4)槐定碱可协同SB203580抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS的表达及NO、TNF-α的释放,表明槐定碱还可通过干预p38 MAPK途径外的其它信号通路抑制LPS诱导的炎症因子表达。
目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素，其污染非常普遍，在粮食作物和食品中存在非常广泛。OTA的主要毒性作用器官是肾脏，OTA可能是巴尔干地方性肾病的主要致病原，1993年国际癌症研究中心IARC将OTA列为“可能的人类致癌物”。除外肾毒性，动物实验研究还发现OTA具有免疫毒性、肝毒性、神经毒性、致突变性、致畸性和致癌性等生物效应。长期食用OTA污染的饲料，可以诱发F344/N大鼠出现前胃上皮细胞增生和乳腺纤维腺瘤。由于在食物中分布的广泛性，人类很容易长期暴露于OTA的毒性环境中。 研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通过引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滞，比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素B1。我们实验室前期研究工作发现，OTA通过下调人胃黏膜上皮细胞周期调控关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达引起细胞G2期阻滞，提示OTA可通过G2期阻滞来发挥其部分毒性作用，在中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）及非洲绿猴肾脏细胞（CV-1）中，OTA也通过导致G2期阻滞来发挥其毒性作用。

丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联是细胞内重要的信号转导系统之一，参与细胞的各种生理及病理活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK（细胞外信号调节激酶）通路，JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶）通路和p38MAPK通路。研究表明在各种刺激因素的作用下，细胞可以通过激活或抑制MAPK信号通路而启动细胞G2期检测点，使细胞发生G2期阻滞。Yang等人发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇介导的G2/M阻滞是通过ERK1/2信号通路增强p_21水平实现的。然而，目前有关OTA诱导人胃黏膜上皮细胞G2阻滞的相关分子机制尚不明了。 那个 鉴于MAPK信号通路在细胞周期中的重要作用，我们提出这样的假设，即MAPK信号通路可能参与OTA诱导的人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。为验证本假设，本实验将观察JNK、ERK和p38MAPK信号通路在OTA诱导的G2期阻滞中的作用，以期揭示OTA诱导体外人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞的可能分子机制。 方法： 1细胞培养与处理 正常人胃黏膜上皮细胞（GES-1）培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养，细胞贴壁生长。 选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予OTA，使其终浓度分别为5、10、20μM，溶剂对照组给予终浓度为0.

05)；对照组、T2DM组和T2DM并CHD组三组间BMI差异无统计学意义(P>0.05)；T2DM、T2DM并CHD组WHR显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01或P0.05)； 2、各组间临床生化指标方面：MAP(mmHg)三组间差异无统计学意义(P>0.05)；对照组、T2DM组和T2DM并CHD组三组FINS、TC、LDL-C、脂蛋白(a)差异无统计学意义(P>0.05);

确认细节 T2DM组、T2DM并CHD组FPG、HOMA-IR、 HbAlc、TG、VLDL-C显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01或P0.05); T2DM组、T2DM并CHD组HDL-C低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且T2DM组与T2DM并CHD组组间差异也有统计学意义(P<0.05);T2DM并CHD组Hs-CRP显著高于T2DM组及对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；T2DM组、T2DM并CHD组Leptin和IMT显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),同时T2DM组与T2DM并CHD组组间差异也有统计学意义(P
术后认知功能障碍(POCD)是术后常见并发症之一,尤其多见于老年人。确切发生机制尚不明确,近年来研究集中于手术、麻醉等引起的炎症反应机制在POCD中的作用。本文就其进行综述,并加以分析。 POCD指麻醉或者手术后病人认知功能的持续性下降,人群中常用的评估工具有简易智能状态检查量表(MMSE)、韦氏成人记忆量表(WMS)、明尼苏达多项人格调查表(MMPI)等。尚缺乏一个权威化检测工具和明确定义。常用的动物实验方法有跳台法、水迷宫、穿梭箱等空间记忆测试方法及味觉厌恶实验、痛觉厌恶实验等感知觉记忆测验.常以长时记忆的形成为标准,尤其是以LTP的形成为测量依据。 POCD的炎症反应机制包括以下几方面：1.炎症细胞。星形胶质细胞阻碍神经再生、释放炎症因子等；活化状态的小胶质细胞释放神经毒性物质,损伤神经元,并以慢性持续活化形成长期作用；中枢神经系统炎症反应会易化外周炎性细胞的浸润,如淋巴细胞、单核细胞,各自以其方式影响认知功能。2.炎症因子。IL-1β可促进神经毒性物质释放,并通过ROS、MAPK等途径造成海马LTP形成受损；TNF-a可促进谷氨酰胺兴奋性神经毒性损伤、易化外周炎症因子浸润、扩大神经系统级联炎症反应等；IL-6可抑制LTP、抑制海马神经元发生并造成其形态变化。各炎症因子的作用在体外动物实验中已得到证实。并且炎症因子联合作用共同损伤神经元。

老年人中枢神经系统炎症因子、炎症细胞本身处于一个较高水平,在应激情况下易发生炎症反应,进而损伤认知功能。 丙泊酚、米诺环素、乌司他丁等药物可以干预中枢神经系统炎症反应,降低循环中炎症因子水平,改善术后认知功能,降低POCD发生率。丙泊酚对认知功能的改善多数是以与吸入麻醉七氟醚比较得出结论。米诺环素、乌司他丁的作用尚需要进一步的动物实验及临床验证 最后,以该综述内容及相关文献为背景,收集数例临床病例,对其中的典型病例发病因素、处理等加以分析。
目的：观察不同氧浓度对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)水通道蛋白-5(AQP-5)的影响,并对其可能机制进行初步探讨。 以及 方法：原代培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分为五组(n=6)：A空白对照组；B LPS组;C LPS+40%O2组；D LPS+60%O2组;ELPS+90%O2组24h后ELISA检测各组细胞TNF-α含量,PT-PCR及Western Blot检测各组细胞AQP-5、p38MAPK mRNA及蛋白表达水平。 结果：1.ELISA结果显示,与A组相比B、C、D、E组TNF-α含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与B组相比C、D、E组TNF-α含量逐渐升高,差异有统计学意义(P
目的 本实验拟建立大鼠腹部不同深度切口模型,观察脊髓背角p-p38MAPK的表达变化,为更合理的研究围手术期应激反应的病理生理过程及疼痛机制提供新模型和思路。

方法 SD大鼠36只,随机分为6组(n=6)：(1)麻醉对照组(A组)：仅麻醉；(2)测压对照组(B组)：仅麻醉和监测；(3)模型组：切口长度均为2cm,根据切割深度不同分为4个亚组,①皮肤组(S组)：仅切割皮肤;②肌肉组(M组)：切割皮肤+肌肉;③腹膜组(P组)：切割皮肤+肌肉+腹膜;④探查组(G组)：切割皮肤+肌肉+腹膜+内脏探查。丙泊酚静脉麻醉下,建立大鼠腹正中切口模型。监测术中生命体征,测量热刺激缩足反射潜伏期(PWTL).观察体重、进食等变化。 另取大鼠32只,随机分为麻醉对照组(C组)和探查组(G2组),根据取标本时间不同,各组分为术后6h,1d,3d,7d四个亚组(n=4),免疫组织化学方法检测大鼠T8-T12节段脊髓背角p-p38MAPK表达的变化。 selleck化学 结果 1.成功建立丙泊酚静脉麻醉下腹部不同深度切口模型。 2.模型组大鼠在切皮、切割完毕／探查完毕后1mmin、缝皮、术毕lmin,·MAP、 PR、 RR均高于基础值(PP>M>S。 3.术中大鼠未出现低血压、缺血缺氧等表现。术后所有大鼠均存活。 4.与A组、B组比较,术后第1d、2d模型组均有不同程度体重和进食下降,差异有显著性(P0.05)。与同时间点A组比较,探查组在术后6h与其有统计学差异(P<0.01)。探查组组内各时间点相比,差异有统计学意义(P
目的：本实验通过体外原代培样的方法建立SD大鼠关节软骨的有限细胞系,在此基础上采用脂联素诱导软骨细胞,观察NOS活性及NO、MMP-3浓度以及NO对MMP-3的影响,探讨脂联素在关节软骨病变发生、发展中的作用。 方法：1.选用SD大鼠的膝关节软骨作为细胞培养的组织来源,建立关节软骨细胞有限细胞系,选用第二代关节软骨为被干预细胞。2.实验1的实验组为0.25μg/ml脂联素组、0.5μg/ml脂联素组和0.75μg/ml脂联素组；对照组为同剂量DMEM培养基,其他条件同实验组。各组干预软骨细胞后,分别在24、48、72小时用硝酸还原酶法测定NO浓度、ELISA法测定NOS及MMP-3浓度。3.实验2的对照组为0.75μg/ml脂联素组；实验A组为0.75μg/ml脂联素联合氨基胍；实验B组为0.75μg/ml脂联素联合地塞米松。各组干预细胞后分别在24、48、72小时用硝酸还原酶法测定NO浓度、ELISA法测定NOS及MMP-3浓度。 结果：1.在实验1中,0.25μg/ml脂联素组的软骨细胞24h、48h、72h分泌的NO浓度与较对照组均显著升高(5.96+1.34vs2.00±0.69P<0.05；8.94±3.20vs2.67±0.37P<0.05；10.98±1.15vs2.78±0.95P<0.05),NOS表达水平也均显著升高(6.90±0.64vs2.43±0.15P<0.05；8.61+0.52vs2.61±0.33P<0.05；11.17±0.76vs3.19±0.31P<0.05；100.6±8.7vs111.5±12.1P<0.05；97.0±3.2vs111.5±12.